Empirisk, gjorts och beräkningstekniker belysa mekanismerna genom vilka fungicider kompromiss bihälsa

Summary

Mikrobiell konsortier inom bumble bee bikupor berika och bevara pollen för bee larver. Detta manuskript med nästa generations sekvensering, tillsammans med laboratorium och fältbaserade experiment, och beskriver protokoll som används för att testa hypotesen att fungicid rester förändra pollen microbiom, och kolonin demografi, vilket slutligen leder till kolonin förlust.

Abstract

Odlare använder ofta fungicid sprayer under Blom för att skydda grödor mot sjukdomen som exponerar bina att fungicid rester. Även om anses ”bee-safe”, finns det montering bevis att fungicid rester i pollen är förknippade med bee nedgång (för både honung och bumble bee arter). Medan mekanismerna är fortfarande relativt okänt, har forskare spekulerat att bee-mikrob Symbiosar är inblandade. Mikrober spelar en central roll i bevarandet eller bearbetning av pollen, som fungerar som näring för larval bin. Genom att förändra mikrobiell gemenskapen, är det troligt att fungicider störa dessa mikrob-medierad tjänster, och därmed äventyra bihälsa. Detta manuskript beskriver de protokoll som används för att undersöka de indirekta mekanismerna som fungicider som orsakar kolonin nedgång. Cage experiment utsätta bina att fungicid-behandlade blommor har redan lämnat det första beviset att fungicider orsaka djupgående kolonin förluster i en native humla (Bombus impatiens). Använder fältet-relevanta doser av fungicider, en serie experiment har utvecklats för att ge en finare Beskrivning av mikrobiell gemenskapens dynamik av fungicid-exponerade pollen. Förskjutningar i strukturella sammansättning av svamp och bakteriella konstellationer inom den pollen mikrobiomet utreds av nästa generations sekvensering och gjorts analys. Experiment som framkallade häri har utformats för att ge en mekanistisk förståelse av hur fungicider påverkar mikrobiomet pollen-bestämmelser. Slutligen, dessa fynd bör belysa den indirekta vägen genom vilken fungicider som orsakar kolonin nedgångar.

Introduction

Hanteras och vilda bee arter upplever utbredda nedgångar, med stora konsekvenser för både naturliga och jordbruks system¹. Trots gemensamma ansträngningar för att förstå orsakerna till problemet, är de faktorer som driver honey bee minskar fortfarande inte förstådda^2,3,4. För vissa arter av vilda, inhemska bin, har situationen blivit ödesdigra^5,6. Om bisamhällena inte kan upprätthållas när de skär med industriellt jordbruk, deras befolkningar kommer att fortsätta att falla och de grödor som kräver pollinatörer (35% av världsproduktionen⁷) kommer att uthärda minskade skördar.

Medan många potentiella faktorer såsom bekämpningsmedel exponering, sjukdom och livsmiljö förlust^1,4,8,9,10 har varit inblandade i honey bee nedgång, relativt är lite känt om interaktiva effekten av dessa stressfaktorer på inhemska bin hälsa, inom eller nära jordbrukssystem. Många aktuella forskningsinsatser fortsätta att fokusera på insektsmedel, (t.ex., neonicotinoids^11,12), även om tidigare forskning visar att fungicider kan också spela en roll i bee nedgång genom att försämra minnesbildning, Olfactory receptionen¹³, boet erkännande¹⁴, enzymaktivitet och metaboliska funktioner^15,16,17. Globalt, fortsätta fungicider att tillämpas på blommande grödor under bloom. Nyare studier har dokumenterat att bina tar vanligen fungicid rester tillbaka till kupan¹⁸, i själva verket, studier har visat en stor andel av testade nässelutslag innehöll fungicid rester^19,20. Ytterligare arbete har visat att fungicid rester är associerade med höga honey bee larval dödlighet^21,22,23 och förekomsten av ”entombed pollen” inom kolonier, som även icke-toxisk, saknar mikrobiell aktivitet och är näringsmässigt komprometterad²⁴. Trots att fungicider har länge ansetts vara ”bee-safe”, finns nu bevis att exponering för fungicid ensam kan orsaka svår kolonin förluster i en native bumble bee art, Bombus impatiens²⁵.

För att fastställa orsakssamband mellan fungicid exponering och kolonin dödlighet, det modus operandi av dessa kemikalier behöver fastställas. Som framgår i jordar²⁶, sediment²⁷och vattenmiljöer²⁸, genom att rikta svampar, fungicider troligen förändra svamp överflöd och mångfalden inom pollen-bestämmelser, därmed åberopa en större gemenskap SKIFT som kan starkt gynna bakterier. Utan svamp konkurrenter eller antagonister, kan vissa patogena bakterier föröka relativt oskyddad, underlätta nedbrytning av pollen-bestämmelser. Tidigare forskning har visat att mikroorganismer, särskilt jäst och filamentösa svampar, tjäna som näringsmässiga symbionter för bin^29,30,31, skyddar mot parasiter och patogener^{32 ,33}, och ger långsiktigt bevarande av pollen butiker. Fungicider, kan därför indirekt skada omogna bina genom att störa mikrobiell gemenskapen som behövs för att tillhandahålla dessa tjänster och/eller genom att öka känsligheten för opportunistiska patogener och parasiter¹². Med ökande krav på livsmedelsproduktion, är grödor i världen att besprutas varje år med fungicider under Blom, vilket understryker behovet av att förstå omfattningen av sådana fungicid-inducerad effekter.

Till-datum, de primära kunskapsluckorna som avser inhemska biet mikrobiell ekologi kan representeras av följande frågor: i vilken utsträckning ändrar fungicid mikrobiell gemenskapen inom bee pollen-bestämmelser? Vad är nedströms effekterna av konsumerar pollen med en djupt förändrade mikrobiell gemenskap? I linje med dessa ekologiskt nära förbunden frågor, framkallades experiment med de primära målen för att avslöja 1) som fungicid rester ensam kan orsaka svår kolonin nedgång i en native bee arter. 2) graden som mikrobiella samhällen i pollen-bestämmelser ändras med fungicider, och 3) hur binas hälsa påverkas av en kraftigt förändrad mikrobiell gemenskap. De experimentella mål definierades för att ta itu med ovanstående frågor med en kombination av laboratorium och fält-baserade experiment. Använda state-of-the-art gjorts och molekylärbiologiska metoder parallellt med traditionella metoder för fältet observation, syftar denna forskning till att pussla ihop de potentiella effekterna av fungicider på bihälsa.

Det första syftet med denna studie är att visa att fungicid exponering ensam kan orsaka betydande kolonin förluster bland infödda bee arter. En studie på stora fältet burar användes för att undersöka effekterna av fungicid exponering på kolonin tillväxten av Bombus impatiens, en allestädes närvarande, riklig infödda bee i USA (figur 1, figur 2, figur 3). Det antogs att fungicid-behandlade bikupor skulle presentera lägre fitness och atypiska demografi jämfört med icke-exponerade nässelutslag. Data som erhållits från detta experiment stödde denna hypotes, visar att fungicid rester inom pollen kan vara den enda orsaken till djupgående kolonin förluster i en native bumble bee arter²⁵. Det andra syftet med denna studie är att undersöka den pollen mikrobiomet svar på fungicid exponering. Det är en hypotes om att annan obehandlad pollen gemenskapen sammansättningen av mikrober inom pollen-bestämmelserna utsätts för fungicider. Medan svamp populationsstorlek och mångfald väntas minska kraftigt, bakterier eller en enda dominerande svamp art kommer sannolikt att växa okontrollerat i avsaknad av andra konkurrerande svampar. Genom en serie av in vivo – studier, kommer att dessa förskjutningar i mikrobiell gemenskapen sammansättning analyseras med metagenomik.

Protocol

1. undersöka effekten av fungicid exponeringen på Bumble Bee kolonin framgång med bur fältexperiment uppsättning upp tio mesh burar i ett fält som är planterad med havre. Gräva ett dike runt varje bur, och gräva alla fyra kanter av mesh buren i marken för att säkerställa att bina inte kan undkomma. Lagerför burar med, blommande krukväxter som är kända för att vara attraktiv för bin (t.ex. bovete, gurkört, alyssum, kosmos och solrosor) ( figur 2). …

Representative Results

Cage fältstudie: Data som erhållits från de bur experiment visade att bumble bee kolonierna hade en betydande svar på fungicid exponering. Fungicid-behandlade bikupor producerad betydligt färre arbetstagare (12,2 ± 3,8, medelvärde ± SE) än kontroll kuporna (43,2 ± 11.2, F1,9= 6,8, p = 0,03) (figur 4). Dessutom var bee biomassa av fungicid-behandlade bikup…

Discussion

Undersökningar om effekterna av fungicider på bins hälsa förblivit en understudied aspekt av pest förvaltningsstrategier. Vår studie syftar till att överbrygga denna kunskap med hjälp av en uppsättning kompletterande tekniker som uttryckligen isolerar de potentiella faktorer som driver bee nedgångar. Planering, logik, och rendering av dessa experiment beskrivs nedan.

Det är viktigt att säkerställa att inga bin tillåts fly maskorna bur experimenten, eftersom detta skulle äventyra…

Materials

Natupol Beehive	Koppert	USRESM1	16 hives
Propiconazole 14.3	Quali-Ppro	60207-90-1	Propiconazole 14.3%
Abound	Syngenta	4033540	Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil	Syngenta	3452	Fungicide used for trials
Pollen granules	Bee rescued	B004D5650C	3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation	Currie Lab
Yeast strains for inoculation	Hittinger lab
Primer pairs	UW Biotech Center
DNA Isolation Kit	Mo Bio	12830-50	Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851	DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX	Thermo Fisher	4472952	Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System	Bio Rad	1855196	Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit,	Axygen	10159-696	Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit	Agilent	5067-1504	Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer	Illumina		Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)	VWR