Abstract
अनुकूली के साथ ही endothelial phenotype और जीन अभिव्यक्ति में रोग परिवर्तन उत्प्रेरण द्वारा सामान्य स्तर और नाड़ी शरीर विज्ञान और pathophysiology में संवहनी द्रव कतरनी खेलने महत्वपूर्ण भूमिकाओं के पैटर्न से विचलन। विशेष रूप से, समय-समय पर, दिशाहीन प्रवाह प्रेरित कतरनी तनाव के प्रभाव maladaptive कई संवहनी सेल प्रकार, विशेष रूप से endothelial कोशिकाओं पर प्रभाव की एक किस्म को गति प्रदान कर सकते हैं। अब तक विविध शारीरिक मूल से endothelial कोशिकाओं सुसंस्कृत किया गया है, में गहराई से तरल पदार्थ कतरनी को अपनी प्रतिक्रिया कतरनी मॉडल के रिश्तेदार जटिलता के द्वारा बाधा उत्पन्न की है का विश्लेषण करती है (जैसे, समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष, कोन और प्लेट प्रवाह मॉडल)। जबकि इन सभी उत्कृष्ट दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं, इस तरह के मॉडल तकनीकी रूप से जटिल हैं और अपेक्षाकृत लंबी और जटिल सेटअप समय, कम सतह क्षेत्रों, पंप और दबाव अक्सर sealants और गास्केट की आवश्यकता के लिए आवश्यकताओं सहित खामियों से ग्रस्त हैं, बीओटी के लिए चुनौतियों का निर्माणबाँझपन और कई प्रयोगों को चलाने में असमर्थता की ज रखरखाव। हालांकि, अगर प्रवाह और कतरनी की उच्च throughput मॉडल उपलब्ध, संवहनी endothelial कतरनी प्रतिक्रियाओं पर अधिक से अधिक प्रगति थे, आणविक स्तर पर विशेष रूप से समय-समय पर कतरनी अनुसंधान, और अधिक तेजी से उन्नत हो सकता है। एक उपन्यास, सरल करने के लिए इकट्ठा, और सस्ती टिशू कल्चर मॉडल एक अपेक्षाकृत बड़े सतह क्षेत्र है कि आसानी से दिशाहीन, समय-समय पर कतरनी तनाव पर अध्ययन में प्रयोगात्मक प्रतिकृति के एक उच्च संख्या के लिए अनुमति देता है के साथ: यहाँ, हम निर्माण और उपयोग कतरनी के छल्ले के वर्णन अन्तःस्तर कोशिका।
Introduction
सीआईएस नियामक तत्व 6 की सक्रियता, हिस्टोन acetyltransferase गतिविधि 7 और कतरनी तनाव प्रतिक्रिया तत्वों (SSRE) 8 के माध्यम से 5 - द्रव कतरनी तनाव endothelial जीन कार्यक्रमों मिलाना 1 दिखाया गया है। ऊतक कारक 9 और ऊतक plasminogen उत्प्रेरक (टीपीए) 10 अभिव्यक्ति नियमन द्वारा जमावट की ओर endothelial योगदान कतरनी तनाव को प्रभावित करती है। कतरनी तनाव भी PDGF-बी संश्लेषण और जवाबदेही 8 विनियमन द्वारा angiogenesis 11 और पोत remodeling के नियंत्रण को प्रभावित करती है। Endothelial व्युत्पन्न vasoactive मध्यस्थों Adrenomedullin, endothelin -1, urotensin द्वितीय और relaxin भी द्वारा कतरनी 12 विनियमित रहे हैं। Endothelial नाइट्रिक ऑक्साइड synthase उत्पादन और नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन का प्रतिलेखन दोनों कतरनी निर्भर 10 हैं। कतरें भी endothelial ICAM-1 अभिव्यक्ति 13 को नियंत्रित करता है। प्रवाह प्रेरित कतरनी तनाव इसलिए शक्तिशाली नेटवर्क को मजबूत कर सकते हैंlly endothelial प्रतिक्रियाओं की एक बड़ी विविधता को प्रभावित करती है। महत्वपूर्ण बात है, नाड़ी स्पंदन अब भी दोनों सामान्य संवहनी उम्र बढ़ने और नाड़ी मनोभ्रंश 14 के रूपों के pathophysiology में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते दिखाई देते हैं और यहां तक कि इस तरह के एकाधिक काठिन्य 15 के रूप में अन्य neurodegenerative रोगों के लिए योगदान कर सकते हैं।
शिरापरक और धमनी endothelial कोशिकाओं स्वाभाविक विवो में विविध रक्तसंचारप्रकरण प्रवाह पैटर्न को उजागर कर रहे हैं, और कई अलग अलग endothelial सेल phenotypes 16 प्रदर्शित किया जा सकता है। परिमाण और प्रवाह की अवधि पर निर्भर करता है, endothelial कोशिकाओं पर प्रभाव भड़काऊ सेल सक्रियण और apoptosis, जो जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति 17,18 में बदलाव को प्रतिबिंबित कर सकते हैं शामिल हो सकते हैं। Endothelial सेल प्रतिक्रिया पर अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल है कि पर्याप्त रूप से इस तरह के कतरनी पैटर्न का उत्पादन में उत्पादन में घटना इसलिए कठिनाइयों से जटिल रह वंचित करने के लिए।
कई अलग अलग experimental प्रोटोकॉल सेल monolayers endothelial के लिए तरल पदार्थ कतरनी तनाव लागू करने के लिए विकसित किया गया है। 21 - सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रणालियों में से एक समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष हैं, जिनमें कक्ष 19 के भीतर वर्दी लामिना का प्रवाह पैदा करता है। एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप आमतौर पर आवधिक प्रवाह है, जो प्रवाह विशेषताओं को आम तौर पर इन विवो 22 में कई स्थानों में पाया पुनरावृत्ति कर सकते हैं बनाने से जुड़ा है। एक अन्य आम सेट-अप 'कोन और प्लेट' मॉडल है, जहां तरल पदार्थ कतरनी तनाव शंकु 23 की घूर्णन गति से निर्धारित होता है उपयोग करता है। दोनों प्रणालियों, और अन्य व्यवस्थाओं के लिए उन्हें समान है, की स्थापना की और घटक है कि अपेक्षाकृत महंगा है और कई प्रयोगशालाओं के लिए दुर्गम हो सकता है की आवश्यकता के लिए कठिन हो सकता है।
इन मौजूदा मॉडलों का एक अन्य प्रमुख सीमा को दोहराने के अध्ययन है कि एक साथ एक अपेक्षाकृत कम सतह क्षेत्र के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है, प्रत्येक की अपेक्षाकृत कम संख्या है। इस बार और सह बढ़ जाती है इस तरह के दृष्टिकोण के mplexity। इसलिए, कि दिशाहीन और समय-समय पर कतरनी लाती एक आदर्श मॉडल एक अपेक्षाकृत बड़े सतह क्षेत्र के साथ एक है जहाँ अध्ययन प्रतिकृति के एक उच्च संख्या आसानी से स्थापित किया जा सकता है, प्रत्येक हो सकता है। इसके अलावा, ऊपर उल्लिखित मॉडल एक काफी परिष्कृत सेटअप है, जो कई उपयोगकर्ताओं के लिए लागत निषेधात्मक हो सकता है की आवश्यकता होती है। एक मॉडल है कि बुनियादी प्रयोगशाला सामग्री का उपयोग कर तरल पदार्थ कतरनी गड़बड़ी उत्पादन कर सकते हैं कई फायदे हो सकता है।
दिशाहीन, समय-समय पर कतरनी तनाव को लागू करने का एक सरल और अत्यधिक किफायती तरीका एक कक्षीय प्रकार के बरतन 24 पर परिपत्र व्यंजनों की नियुक्ति शामिल है। इस प्रोटोकॉल बहुत सरल है और जरूरत के रूप में बढ़ाया जा सकता है उच्च संख्या के अध्ययन के प्रतिकृति, एक अपेक्षाकृत बड़े क्षेत्र की सतह के साथ प्रत्येक को प्राप्त करने के लिए। हालांकि, डिश के केंद्र में स्थित कोशिकाओं परिधि के साथ कोशिकाओं की तुलना में अलग प्रवाह पैटर्न को उजागर कर रहे हैं, एक ही थाली में मिश्रित सेलुलर प्ररूपी प्रतिक्रियाओं से बेदखल।
_content "> इस वर्तमान रिपोर्ट में, हम निर्माण और 'कतरनी के छल्ले', दिशाहीन और समय-समय पर कतरनी तनाव पैदा करने के लिए हमारे मॉडल के उपयोग कतरनी की अंगूठी के लिए प्रभावी ढंग से सीमा 'मिश्रित' सेलुलर कतरनी प्रेरित phenotypes प्रवाह सीमित द्वारा वर्णन करते हैं। डिजाइन एक इनर रिंग के प्लेसमेंट के माध्यम से परिधि को एक परिपत्र संस्कृति डिश के भीतर मार्ग। निर्माण और कतरनी अंगूठी के संचालन को सरल और किफायती है और आसानी से व्यापक रूप से उपलब्ध टिशू कल्चर की आपूर्ति का उपयोग कर कक्षीय शेकर्स की एक विस्तृत श्रृंखला को समायोजित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। इस मॉडल शारीरिक और pathophysiological स्तर के भीतर दिशाहीन और आवधिक प्रवाह पैटर्न प्रदान करने के लिए endothelial सेल प्रयोगों में लागू किया जा सकता है।Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 150 मिमी व्यास कतरें अंगूठियों का निर्माण (चित्रा 1)
नोट: कतरें के छल्ले, बाहरी और भीतरी पेट्री डिश आकार बदलती अलग कुल सतह क्षेत्रों, सेल पैदावार के साथ उपकरणों में जिसके परिणामस्वरूप और विकसित कतरनी बलों की सीमाओं से कई अलग अलग आयाम बनाने के लिए निर्माण किया जा सकता है। इस रिपोर्ट में एक 150 मिमी 98 सेमी 2 (चित्रा 2) के कुल सतह क्षेत्र के लिए एक आंतरिक 100 मिमी पकवान के साथ संयुक्त पकवान का वर्णन है।
चित्रा 1. कतरें अंगूठी विधानसभा। आंकड़ा के शीर्ष भाग एक आंशिक रूप से इकट्ठे कतरनी अंगूठी पता चलता है। एक हस्तांतरण pipet के साथ 3 मिमी छेद के माध्यम से क्लोराइड के 0.5 मिलीलीटर इंजेक्षन अगर एक तंग सील पूरी तरह से भीतरी और बाहरी बर्तन के बीच का गठन नहीं किया है। कतरनी अंगूठी भीतरी ईडीजी आसपास सिलिकॉन रबर चिपकने के एक 1 मिमी मोटी मनका लगाने से बंद बंद हैकतरनी अंगूठी शीर्ष के ई। चित्रा के नीचे के हिस्से इकट्ठे कतरनी अंगूठी पता चलता है। नीले रंग चढ़ाया endothelial कोशिकाओं के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। बाहरी और भीतरी लाल तीर कतरनी की अंगूठी और जब एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर रखा कतरनी रिंग के अंदर मीडिया की कक्षीय गति से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. एक 150 मिमी कतरनी की अंगूठी (नहीं पैमाने पर करने की तैयार की गई) के लिए सतह माप। शीर्ष पैनल कक्षीय रोटेशन के जवाब में बाहरी रिंग के प्रति तरल पदार्थ की केन्द्रापसारक स्थानांतरण पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
- एक उत्पन्न करके एक कतरनी अंगूठी निर्माण टेम्पलेट बनाएँएक 100 मिमी आंतरिक 150 मिमी वृत्त के केंद्र में रखा व्यास के साथ प्रस्तुति सॉफ्टवेयर में 150 मिमी बाहरी छोर प्रोफ़ाइल। ए 4 सफेद कागज के एक पत्रक पर प्रिंट टेम्पलेट।
- Pipet एक 150 मिमी गिलास पेट्री डिश में क्लोराइड (क्लोराइड) के 10 मिलीलीटर। यह महत्वपूर्ण है कि पकवान, कांच और न polystyrene (या अन्य विनाइल प्लास्टिक) के रूप में है क्लोराइड सबसे प्लास्टिक solubilizes और यहाँ प्रयोग किया जाता है प्लास्टिक के घटकों में शामिल होने के लिए।
चेतावनी: पर्याप्त वेंटिलेशन हुड के साथ सभी निर्माण के लिए दस्ताने का प्रयोग करें। क्लोराइड संपर्क अड़चन है और यकृतविषकारी है। - बाहरी रिंग कतरनी टेम्पलेट पर एक 150 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश संरेखित करें।
- एक रोटरी उपकरण का उपयोग कर एक 100 मिमी पकवान के केंद्र में एक 3 मिमी छेद ड्रिल। ड्रिलिंग से उत्पादित किसी भी प्लास्टिक छीलन निकालें।
- एक दस्ताने हाथ से पकड़े, पलटना और लगभग 3 सेकंड के लिए क्लोराइड के पूल में पिछले चरण से 100 मिमी पेट्री डिश के शीर्ष बढ़त डुबकी।
- ट्रांसफेर "गीला" एक 150 मिमी पकवान के केंद्र पर 100 मिमी पकवान किनारे से नीचे, ध्यान से चिह्नित टेम्पलेट पर 100 मिमी पकवान संरेखित। क्लोराइड प्लास्टिक फ्यूज होगा, 100 मिमी और 150 मिमी बर्तन में शामिल होने। धीरे 100 मिमी पकवान दक्षिणावर्त बारी बारी से और कुछ ही समय वामावर्त 150 मिमी पकवान के लिए अच्छा आसंजन सुनिश्चित करने के लिए।
ध्यान दें: बाहरी डिश के केंद्र के भीतरी पकवान की उचित संरेखण सुनिश्चित करने के लिए महान ख्याल रखना। सनकी संरेखण कतरनी रिंग में विभिन्न स्थानों पर कतरनी तनाव के रूपों में हो सकता है। क्लोराइड गलती से 100 मिमी पकवान की प्लेसमेंट के दौरान 150 मिमी पेट्री डिश के बाहरी हिस्से को ट्रैक पर ड्रिप करने की अनुमति नहीं करने के लिए ध्यान रखना। यह नीचे की सतह जहां कोशिकाओं बढ़ जाएगा पर प्लास्टिक पिघल, एक असमान सतह कि प्रवाह गड़बड़ी का कारण बन सकता बनाने होंगे। - एक बार जब क्लोराइड सूख गया है, नव बाध्य पेट्री डिश पर फ्लिप और ध्यान से संपर्क के अंक का निरीक्षण किया है कि यह सुनिश्चित करने केएक तंग सील दो पेट्री डिश के बीच का गठन किया गया है।
- एक तंग सील पूरी तरह से गठन नहीं किया गया, तो एक हस्तांतरण pipet के साथ 3 मिमी छेद के माध्यम से क्लोराइड के 0.5 मिलीलीटर इंजेक्षन। डिश उठाओ और धीरे यह क्लोराइड किनारे तक पहुंचने के लिए अनुमति देने के लिए बारी बारी से।
नोट: अगर बहुत जल्दी घुमाया, क्लोराइड 150 मिमी पकवान के बाहरी हिस्से में फैल सकता है, सतह जहां कोशिकाओं से विकसित होगा विरूपण और कतरनी अंगूठी को बर्बाद कर। लीक कतरनी छल्ले खारिज किया जाना चाहिए। - सिलिकॉन रबर सीलेंट की एक 3 मिमी मनका लगाने से 100 मिमी डिश में छेद बंद सील।
- एक फ्लैट काटने के सिर के साथ लगे एक रोटरी उपकरण का उपयोग, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार polystyrene टिशू कल्चर ट्यूब के शीर्ष 3 सेमी हिस्से को काट, टोपी नीचे ट्यूब के कम से कम 1 सेमी छोड़ने। चिकनी और सपाट काटने के सिर के फ्लैट की ओर का उपयोग कर जब तक कटौती ट्यूब के किनारे पॉलिश। पीस द्वारा उत्पादित किसी भी प्लास्टिक छीलन निकालें।
- पर काट 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब ट्रेसएक मार्कर, पकवान के किनारे से लगभग 0.5 सेमी की दूरी के साथ 150 मिमी डिश के ढक्कन। तैयार सर्कल के अंदर एक छेद ड्रिल, लगभग सर्कल के किनारे से 1-2 मिमी एक मार्जिन छोड़ने।
- drilled छेद पर शंक्वाकार ट्यूब शीर्ष काट रखें। एक हस्तांतरण pipet का प्रयोग, 150 मिमी ढकने के लिए शंक्वाकार ट्यूब बाध्य करने शंक्वाकार ट्यूब की काट किनारों को क्लोराइड के लगभग 250 μl लागू होते हैं।
- शीर्ष पेट्री डिश के भीतरी किनारे के आसपास सिलिकॉन रबर सीलेंट के एक 1 मिमी मोटी मनका लगाने से 150 मिमी पकवान पर 150 मिमी ढक्कन सील।
2. कतरें अंगूठियों का बंध्याकरण
- Pipet लगभग फॉस्फेट के 10 मिलीलीटर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पोर्ट के माध्यम से नवगठित कतरनी रिंग में खारा बफर। कतरनी रिंग के अंदर किसी भी मलबे को हटाने के चारों ओर चक्कर आने। एक पाश्चर pipet / वैक्यूम खींचने की मशीन के साथ फॉस्फेट बफर खारा निकालें।
- पिछले चरण दोहराएँ जब तक मलबा हटा दिया जाता है।
- steri करने के लिएLize कतरनी की अंगूठी, पराबैंगनी विकिरण के साथ एक 70% इथेनॉल कुल्ला का एक संयोजन का उपयोग करें।
- पहुँच पोर्ट के माध्यम से निकाल टोपी, pipet 70% इथेनॉल के लगभग 10 मिलीलीटर खोल देना, और पीठ पर टोपी पेंच। बारी बारी से और कतरनी अंगूठी कई बार फ्लिप, यह सुनिश्चित करना है कि कतरनी रिंग के अंदर अच्छी तरह से धोया जाता है।
- एक धूआं हुड के तहत, अतिरिक्त 70% इथेनॉल के बाहर aspirate। एक स्प्रे बोतल के साथ, अच्छी तरह से स्प्रे 70% इथेनॉल के साथ टोपी और उपयोग बंदरगाह।
- कतरनी की अंगूठी और टिशू कल्चर हुड के भीतर पराबैंगनी विकिरण के तहत टोपी पूरी तरह से सूखे जब तक रखें।
- एक बार सूखा, कमरे के तापमान पर पीठ पर टोपी और दुकान निष्फल कतरनी छल्ले पेंच जब तक सेल संस्कृति चढ़ाना में इस्तेमाल किया।
3. कतरनी तनाव अध्ययन
- बदल endothelial सेल लाइनों के लिए 4 विभाजन अनुपात: मानक सेल संस्कृति आम तौर पर एक 1 का उपयोग कर प्रोटोकॉल के बाद निष्फल कतरनी के छल्ले में endothelial कोशिकाओं थाली।
नोट: चूहा रेटिना microvascular endothelial कोशिकाओं व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया। मानव मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं (hCMEC / डी 3) कोशिकाओं डॉ पियरे-ओलिवर Couraud (INSERM, फ्रांस) से एक उदार उपहार के रूप में प्रदान की जाती है और पूरा endothelial बेसल मध्यम (ईबीएम) में सभ्य थे। - संस्कृतियों के अध्ययन के प्रवाह की दीक्षा से पहले संगम तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं। टिशू कल्चर मीडिया के 30 मिलीलीटर (10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन / amphotericin साथ Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम) का प्रयोग करें। सेल संस्कृति के माध्यम से परिवर्तन हर 3 दिन और 7.5% सीओ 2 और 92.5% कमरे में हवा के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखने।
- इनक्यूबेटर में कक्षीय प्रकार के बरतन रखें।
नोट: कक्षीय शेकर्स आम तौर पर भारी हैं (> 10 किलो)। शेल्फ तनाव और कंपन को कम करने के लिए इनक्यूबेटर के नीचे शेल्फ पर कक्षीय प्रकार के बरतन रखें। - कक्षीय प्रकार के बरतन पर प्रयोगात्मक कतरनी छल्ले रखें। एक ही मशीन के अंदर स्थिर नियंत्रण समूह कतरनी छल्ले रखें।
- श के भीतर अधिकतम कतरनी तनाव का अनुमानसमीकरण के साथ कान की अंगूठी
कहा पे 
(सेमी में) कक्षीय प्रकार के बरतन के लिए रोटेशन की त्रिज्या है, 
(शिष्टता में) मध्यम चिपचिपाहट की है, 
मध्यम का घनत्व (छ / मिलीलीटर में), और 
रोटेशन की आवृत्ति 24 (रोटेशन / सेकंड में) है। - वांछित आरपीएम (जैसे, 90 आरपीएम) करने के लिए कक्षीय प्रकार के बरतन पर रोटेशन सेटिंग आरंभ, कतरनी तनाव आवेदन (जैसे, 72 घंटा) के वांछित अवधि के लिए एक प्रकार के बरतन पर कतरनी छल्ले जा रही है।
नोट: कक्षीय शेकर्स, गर्मी का उत्पादन कर सकते हैं तो इनक्यूबेटर तापमान शुरू में निगरानी की जानी चाहिए सुनिश्चित करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस प्रयोग की अवधि में बनाए रखा है। वैकल्पिक रूप से, एससुनते छल्ले पर्यावरण कक्षों (जैसे, मॉड्यूलर इनक्यूबेटर चैम्बर) और फिर एक घूर्णन इनक्यूबेटर के भीतर रखा में स्थानांतरित किया जा सकता है। - बाद सेल परतों समय के वांछित लंबाई के लिए कतरनी, इनक्यूबेटर से कतरनी के छल्ले को दूर उजागर किया गया है। कतरनी अंगूठी ढक्कन हटा और वांछित समापन बिंदु का विश्लेषण करती है (उदाहरण के लिए, पश्चिमी सोख्ता, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी, आदि), 25 की जांच के लिए कोशिकाओं और / या मीडिया निकालते हैं।
कहा पे Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
यहाँ हम दोनों hCMEC / डी 3 मस्तिष्क endothelial सेल और चूहे रेटिना microvascular endothelial सेल monolayers, कतरनी के छल्ले में सुसंस्कृत से प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत करते हैं।
hCMEC / डी 3 मस्तिष्क endothelial सेल monolayers पूरा ईबीएम में संगम के लिए विकसित करने के लिए अनुमति के बाद, कतरनी के छल्ले 72 घंटे के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर रखा गया था। 3.5 कदम से समीकरण का उपयोग करना, अधिक से अधिक कतरनी तनाव गणना 
था लगभग 2.8 dynes / 2 सेमी (मापदंडों के साथ 
= 0.95 सेमी, 
= 0.0101 शिष्टता, 
= 0.9973 ग्राम / मिलीलीटर 24, 
= 1.5 घुमाव / दूसरे )। हमने पाया है कि इन endothelial सेल monolayers कभी कभी आवधिक प्रवाह (चित्रा 3) की दिशा के साथ समानांतर में संरेखण दिखा रहे हैं, हालांकि यह समान रूप से नहीं मनाया जाता है क्योंकि सेल परतों आमतौर पर अध्ययन के दौरान कतरनी अंगूठी की सतह के लिए उत्कृष्ट आसंजन है।
अनुमति के बाद चूहे रेटिना microvascular endothelial सेल monolayers EGF / वीईजीएफ़ वृद्धि कारक की खुराक सहित पूरा चूहे endothelial सेल मध्यम, में संगम के लिए विकसित करने के लिए, कतरनी के छल्ले 72 घंटे के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर रखा गया था। 3.5 कदम से समीकरण का उपयोग करना, अधिक से अधिक कतरनी तनाव गणना था लगभग 12 dynes / 2 सेमी (मापदंडों के साथ = 0.95 सेमी, = 0.0101 शिष्टता,Iles / ftp_upload / 54632 / 54632eq4.jpg "/> = 0.9973 ग्राम / मिलीलीटर 24, = 4 घुमाव / सेकेंड)। चित्रा 4 से पता चलता है कि β-actin की लोडिंग नियंत्रण की तुलना में, वहाँ endothelial सेल सतह से प्लेटलेट endothelial सेल आसंजन अणु (PECAM-1 / CD31) की एक बड़ी और महत्वपूर्ण नुकसान था।
PECAM-1 एक अभिन्न झिल्ली प्रोटीन जो इम्युनोग्लोबुलिन (आईजी) -superfamily कि एक immunoreceptor tyrosine निर्भर निरोधात्मक मूल भाव या 'Itim' 26 में शामिल है के एक सदस्य है। PECAM -1 केवल endothelial कोशिकाओं पर व्यक्त नहीं कर रहा है, लेकिन यह भी hematopoietic कोशिकाओं पर पाया जाता है। PECAM-1 निभाता endothelial सेल सेल आसंजन, ल्युकोसैट जंक्शनल स्थानांतरगमन, सेल संकेतन में महत्वपूर्ण भूमिका है, और महत्वपूर्ण बात, कतरनी तनाव के mechano पारगमन। कतरनी तनाव संवेदन में PECAM-1 की भूमिका संवहनी endotheli के कार्यों के लिए महत्वपूर्ण है अल कोशिकाओं और homeostasis 17। Endothelial monolayers तनाव वंचित करने के लिए सामने आ रहे हैं, PECAM-1 यांत्रिक बल अपनी tyrosine फोस्फोराइलेशन बदलकर उस पर लगाए गए जा रहा है, और ERK1 / 2 झरना 27 के संकेत के बाद के सक्रियण के लिए सीधे प्रतिक्रिया करता है। इसके अलावा, PECAM-1-एनोस जटिल एसोसिएशन कतरनी तनाव 28 में गड़बड़ी से बाधित है। इसलिए, PECAM-1 द्रव कतरनी तनाव बलों में परिवर्तन जो पोत दीवार 29 के प्रतिक्रियाशील फैलाव का कारण बन सकता भावना के लिए संवहनी endothelial कोशिकाओं में सक्षम बनाता है।
ये आंकड़े इस मॉडल दिखा रहा है कि endothelial कोशिकाओं नीचे विनियमन एक महत्वपूर्ण जंक्शनल और चिपकने वाला निर्धारक, जो कहनेवाला संपर्क के रूप में अच्छी तरह से transvascular सेल विनिमय मध्यस्थता द्वारा समय-समय पर, दिशाहीन द्रव कतरनी के लिए जोखिम का जवाब समर्थन करते हैं।
632fig3.jpg "/>
एक कतरनी रिंग में चित्रा 3. मस्तिष्क endothelial सेल आकृति विज्ञान। आवधिक द्रव कतरनी या स्थिर जोखिम के 48 घंटे के बाद कतरनी के छल्ले में hCMEC / D3endothelial सेल monolayers की उपस्थिति। संस्कृतियों के संरेखण हमेशा दिशा प्रवाह करने के लिए (तीर द्वारा दिखाया गया है)। समानांतर नहीं मनाया जाता है कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. आवधिक कतरनी के लिए सेल प्रतिक्रिया। चूहा रेटिना microvascular endothelial सेल monolayers कतरनी के छल्ले में सुसंस्कृत बीटा actin दिखाया में PECAM1 / CD31 रिश्तेदार कमी करने के लिए, (एन = unpaired टी परीक्षण 3 प्रत्येक, छात्रों, * पी <0.05, त्रुटि सलाखों के मानक विचलन को देखें) समय-समय पर तरल पदार्थ एक प्रकार का वृक्ष के 72 घंटे के बादकतरनी के छल्ले में आर।
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Discussion
endothelial कोशिकाओं को प्रकाश में लाने के लिए कतरनी कतरनी अंगूठी प्रणाली के निर्माण कतरनी तनाव के अध्ययन के प्रदर्शन के लिए एक सरल तरीका है। फिर भी, वहाँ कुछ कदम है कि बेहतर कतरनी के छल्ले और बेहतर परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। एक पूरा मुहर लीक जो नमूने के बीच असंगत कतरनी तनाव बना सकता से मीडिया को रोकने के लिए आंतरिक और बाहरी रिंग के बीच किया जाना चाहिए। एक पूरा मुहर नहीं किया जाता है, क्लोराइड की एक न्यूनतम राशि आंतरिक रिंग में छेद के माध्यम से एक हस्तांतरण pipet के साथ भीतरी और बाहरी पकवान के बीच किनारे करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए। धीरे अंगूठी घूर्णन क्लोराइड एक पूरा मुहर के रूप में करने के लिए अनुमति चाहिए। इसके अलावा, प्लास्टिक छीलन अनजाने काटने से उत्पादित, कतरनी अंगूठी ट्रैक पर मौजूद हो सकता है इसलिए निर्माण के बाद कतरनी अंगूठी बाहर rinsing किसी भी मलबे कि प्रतिकूल सेल के विकास को प्रभावित करते हैं और असंगत कतरनी तनाव आवेदन दे सकते हैं दूर करना चाहिए।
रोंसुनते आलेख में वर्णित के छल्ले के आकार में अपेक्षाकृत बड़े हैं, नमूना प्रति उत्पादन का एक उच्च मात्रा के लिए अग्रणी। हालांकि, छोटे संस्करण छोटे पेट्री डिश का उपयोग कर निर्माण किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एक 60 मिमी डालने के साथ 100 मिमी पेट्री डिश)। अध्ययन की प्रतिकृति, जबकि अभी भी अपेक्षाकृत बड़ी तरल पदार्थ की मात्रा और नमूना प्रति सतह क्षेत्रों को बनाए रखने के लिए जब अन्य तरीकों की तुलना में निर्माण कई छोटे कतरनी के छल्ले अधिक संख्या के लिए अनुमति दे सकता है।
जब कतरनी के छल्ले का उपयोग कर कुछ मुद्दों का उल्लेख किया गया है। सबसे पहले, कुछ कक्षीय शेकर्स गर्मी से अधिक मात्रा में उत्पादन, और कुछ इन्क्यूबेटरों तापमान में इस वृद्धि को नियंत्रित करने के लिए असफल। इस rotators का उचित चयन और गैर-पानी तख्ताबंदीवाला इन्क्यूबेटरों है, जो बहुत अधिक आसानी से गर्मी का आदान-प्रदान के उपयोग से बचा जा सकता है। संस्कृति संदूषण एक और संभावित चिंता का विषय है जब कतरनी के छल्ले का उपयोग कर, विशेष रूप से एक खुली हवा में वातावरण में विधानसभा निम्नलिखित है। कतरें छल्ले को अच्छी तरह से उपयोग करने से पहले निष्फल होना चाहिए।
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Disclosures
जे Winny यूं एनेट Funicello फाउंडेशन से एक शोध अनुदान है। जे स्टीवन अलेक्जेंडर न्यूरोलॉजी, LSUHSC-एस विभाग से अनुसंधान का समर्थन किया है।
Acknowledgments
लेखकों श्री क्रिस्टोफर गुयेन, हारून हंटर और Shreveport जम्पस्टार्ट, स्मार्ट, और Biostart प्रशिक्षण कार्यक्रमों की सहायता के साथ-साथ लुइसियाना के शताब्दी कॉलेज बायोफिज़िक्स, Shreveport, ला विभाग को स्वीकार करना होगा।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430167 | The dishes must be polystyrene |
| 150 x 25 mm plastic tissue culture dish | Corning | 430599 | The dishes must be polystyrene |
| 150 mm glass Petri dish | Fisher | 3160150BO | |
| 15 ml polystyrene tissue culture plastic tubes | Falcon | 352099 | |
| Methylene chloride | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| silicone rubber sealant | DAP | 7079808641 | |
| ethanol | Decon | 2701 | |
| 3 ml transfer pipette | Becton-Dickinson | 357524 | |
| printer paper | |||
| scissors | |||
| gloves | |||
| rotary tool and set | Dremel | 4000-6/50 | |
| rotary tool cutting head | Dremel | EZ476 | |
| rotary tool drill head | |||
| distilled water | |||
| orbital shaker | VWR | 57018-754 | |
| incubator | |||
| Rat retinal microvascular endothelial cells | Cell Biologics | RA-6065 |
References
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. FASEB J. 9 (10), 874-882 (1995).
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