En fluorescens-baserte analysen av fosfolipid Scramblase aktivitet

Summary

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Abstract

Scramblases translocate fosfolipider over membranen bilayer bidirectionally i en ATP-uavhengig måte. Den første scramblase å bli identifisert og biokjemisk bekreftet ble opsin, apoprotein av fotoreseptoren rhodopsin. Rhodopsin er et G-protein-koblet reseptor lokalisert i stang fotoreseptorlidelser skive membraner av netthinnen der den er ansvarlig for oppfatningen av lys. Rhodopsin er scramblase aktivitet ikke er avhengig av sin ligand 11- cis -retinal, dvs. at apoprotein opsin også aktiv som scramblase. Selv konstituerende og regulert fosfolipid scrambling spille en viktig rolle i cellefysiologi, har bare noen få fosfolipid scramblases blitt identifisert så langt foruten opsin. Her beskriver vi en fluorescens-basert analyse av opsin er scramblase aktivitet. Opsin rekonstitueres i store unilamellære liposomer sammensatt av phosphatidylcholine, fosfatidylglycerol og et spor mengde fluorescerende NBD-merket PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-yl) amino] heksanoyl} – sn -glycero-3-fosfokolin). Scramblase aktivitet bestemmes ved å måle i hvilken grad NBD-PC-molekyler som befinner seg i den indre paknings av vesikkel er i stand til å få tilgang til det ytre paknings hvor deres fluorescens blir kjemisk fjernet ved et reduksjonsmiddel som ikke kan krysse membranen. Metodene vi beskriver ha generell anvendelighet og kan brukes til å identifisere og karakterisere scramblase aktivitetene til andre membranproteiner.

Introduction

Den fotoreseptoren rhodopsin, en prototypisk G-protein-koblet reseptor (gjennomgått for eksempel i referanse ^1), er den første fosfolipid scramblase å bli identifisert og bekreftet biokjemisk ^2,3. Scramblases er fosfolipid transportører som øker egen langsomme transbilayer fosfolipid bevegelse til fysiologisk riktig nivå i en toveis, ATP-uavhengig måte ^4-6. Eksempler på sine handlinger kan bli funnet i det endoplasmatiske retikulum og bakterie cytoplasmiske membran hvor konstitutiv scrambling er nødvendig for membran homeostase og vekst, så vel som for en rekke av glykosyleringsseter veier ^5. Regulert fosfolipid scrambling er nødvendig for å eksponere fosfatidylserin (PS) på overflaten av apoptotiske celler hvor det fungerer som en "spise-me" -signal for makrofager ⁷ og gir et prokoagulerende overflate på aktiverte blodplater for å katalysere produksjonen av protein faktors behov for blodpropp. I fotoreseptorlidelser platemembraner, har rhodopsin s scrambling aktivitet blitt foreslått for å motvirke fosfolipidet ubalansen mellom de to membran brosjyrer av bilaget som er generert av den ATP-avhengige, ensrettet lipid flippase ABCA4 ^{4,8,9 10-12.}

Til tross for den fysiologiske betydningen av scramblases forble deres identitet unnvikende til rhodopsin ble rapportert som en scramblase i fotoreseptorlidelser plater ^2, medlemmer av TMEM16 protein familien ble identifisert som Ca ^{2 +} -avhengige scramblases trengs for PS eksponering på plasmamembranen (anmeldt i referanse ^13), og den bakterielle protein FtsW ble foreslått som en Lipid II scramblase kreves for peptidoglykansyntesen ^14. Disse funnene var basert på tilberedning av rensede proteiner i liposomer og demonstrasjon av scramblase aktivitet i de resulterende proteoliposomes bruk av metodikken described her. Andre potensielle scramblases ^15-21 – de MurJ og AMJ proteiner involvert i peptidoglykan biosyntese, WzxE og relaterte proteiner involvert i scrambling O-antigen forløpere, MprF protein trengs for å translocate aminoacylert fosfatidylglycerol over bakteriell cytoplasmamembranen, og Xkr8 familiemedlemmer som har blitt foreslått å eksponere PS på overflaten av apoptotiske celler – gjenstår å bli testet biokjemisk. Dette understreker viktigheten av en robust analyse for å identifisere og karakterisere scramblase aktivitet.

Her beskriver vi tilberedning av renset opsin, den apoprotein av fotoreseptoren rhodopsin, i store unilamellære vesikler (LUV), og påfølgende analyse av scramblase aktivitet i de resulterende proteoliposomes med en fluorescens-basert analysen. Det finnes flere brønn beskrevne protokoller som er tilgjengelige i litteraturen for heterolog ekspresjon og rensing av opsin, derfor vil vi ikkebeskrive det i denne protokollen; vi bruker protokollene beskrevet i Goren et al. ³ som gir FLAG-merket, termostabile opsin på ca 100 ng / mL i 0,1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM).

Rekonstituering er oppnådd ved å behandle LUV med tilstrekkelig vaskemiddel slik at de sveller, men ikke oppløses. Under disse betingelser, en membranprotein – tilføres i form av protein-vaskemiddel miceller – integreres inn i liposomene og bli rekonstituert i liposom-membranen ved fjerning av detergent, noe som resulterer i proteoliposomes. For å rekonstituere opsin (oppnådd som et renset protein i 0,1% (w / v) DDM), LUV er fremstilt fra en blanding av POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfokolin) og POPG (1- palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3- [fosfor-rac- (1-glycerol)]) og mettet med DDM før du legger opsin og NBD-PC. Vaskemiddelet blir deretter fjernet ved behandling av prøven med polystyrenkuler.

<p c lass = "jove_content"> Prinsippet fluorescens-baserte analysen er vist i figur 1B. LUV er symmetrisk rekonstitueres med spormengder av NBD-PC eller en annen NBD-merket fluorescerende fosfolipid reporter (figur 1A). Ved tilsetning av ditionitt, er et membran-impermeant dianion, blir NBD-PC-molekylene i den ytre paknings av LUV gjort ikke-fluorescerende som nitrogruppen av NBD redusert til en ikke-fluoriserende amino-gruppe. Som verken NBD-PC-molekyler eller ditionitt er i stand til å krysse membranen på tidsskalaen for forsøket (<10 min), dette resulterer i 50% reduksjon av det fluorescerende signal. Men hvis liposomene er rekonstituert med en scramblase kan NBD-PC-molekylene i den indre paknings rykke hurtig til utsiden, hvor de er redusert. Dette resulterer i totalt tap av fluorescens i det ideelle tilfellet (figur 1C).

es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
Fig. 1: Skjematisk fremstilling av scramblase aktivitetsanalysen Analysen benytter et fluorescerende NBD-merkede rapportør lipid; NBD-PC er vist (A). Store unilamellære vesikler er rekonstruert med en spormengde NBD-PC. Tilberedning produserer symmetriske vesikler, med NBD-PC fordelt likt i de ytre og indre brosjyrer. Ditionitt (S ₂ O ₄ ^2-) reduserer kjemisk nitrogruppen av NBD til en ikke-fluoriserende amino-gruppe. Behandling av proteinfrie liposomer med ditionitt (B, topp) forårsaker en 50% reduksjon av fluorescens, siden bare de NBD-PC-molekylene i den ytre paknings blir redusert: ditionitt er negativt ladet og kan ikke krysse membranen til å reagere med NBD-PC-molekyler i indre pakningsvedlegget. Dithionite behandling av opsin holdig proteoliposomes (B, nederst), dvs. scramblase-aktiv proteoliposomes, resulterer i 100% tap av fluorescence som opsin forenkler bevegelse av NBD-PC mellom den indre og den ytre pakningsvedlegget. (C) viser idealiserte fluorescens spor innhentet på å behandle proteinfrie liposomer og opsin holdig proteoliposomes med dithionite. Hastigheten av fluorescens tap er den samme i begge tilfeller som indikerer at den kjemiske reduksjonen av NBD av ditionitt er hastighetsbegrensende, og at scrambling skjer med en hastighet lik eller større enn hastigheten av den kjemiske reaksjon. Spor hentet fra en faktisk eksperiment er vist i figur 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Metodene vi beskrive kan brukes til å rekonstituere og analysere andre rensede proteiner, så vel som blandinger av membranproteiner som oppnås, for eksempel ved ekstrahering med mikrosomer vaskemiddel ^22.

Protocol

1. Utarbeidelse av liposomer og Proteoliposomes liposomdannelse Ved hjelp av en glassprøyte, tilsett 1435 mL POPC (25 mg / ml, i kloroform) og 160 ul POPG (25 mg / ml, i kloroform) til en rundbunnet kolbe for å oppnå 52,5 umol lipider i et molforhold på POPC: POPG = 9: 1. Tørk lipidene i 30 minutter ved anvendelse av en rotasjonsfordamper ved en rotasjonshastighet på 145 rpm (ingen vannbad er nødvendig for dette volum av oppløsningsmiddel), og deretter overføre kolben til en vakuum…

Representative Results

Vi beskriver tilberedning av opsin inn LUV å karakterisere sin scramblase aktivitet ved hjelp av en fluorescens-basert analysen. Vi analysere resultatene for å sette en nedre grense for frekvensen av opsin-mediert fosfolipid scrambling og for å bestemme den oligomere tilstand i hvilken opsin funksjonelt rekonstruerer inn i vesiklene. For å identifisere optimale omdanningsbetingelser, er det nødvendig å bestemme empirisk …

Discussion

Den scramblase aktivitetsanalyse gjort oss i opprinnelig å fastslå at opsin har fosfolipid scramblase aktivitet ^2. Analysen har også tillatt oss å karakterisere opsin s scramblase virksomhet ved å teste spesifisiteten (vi brukte en rekke NBD-merkede rapportør lipider så som NBD-fosfatidyletanolamin, merket med NBD på en acylkjede som er vist for NBD-PC i figur 1A, eller på hodegruppe, NBD-sphingomyelin eller NBD- fosfatidylserin ^2), effekten av vesikkel lipid sammensetning…

Materials

1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850457C	POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	840457C	POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-an-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	810130C	NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid	VWR Scientific	EM-5330	HEPES
NaCl	Sigma	S7653-1KG	NaCl
Dodecyl-β-d-maltoside	Anatrace	D310 5 GM	DDM
Fluorimeter cuvettes	sigma	C0918-100EA	cuvettes
Spectrofluorometer	Photon Technology International, Inc.		fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85%	Sigma	157953-5G	dithionite
GraphPad Prism 5 software			Prism
Tris Base	VWR	JTX171-3	Tris
LIPEX 10 mL extruder	Northern Lipids, Inc.		Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm	Sigma	28156-243	Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110607	400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110606	200 nm membrane
sodium phosphate	Sigma	S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13×100 mm	VWR Scientific	47729-572	glass tubes
Perchloric acid	Sigma	30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Sigma	A-7302	ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma	A7631-25G	sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents	Bio Rad	1523920	polystyrene beads
2.0 mL Microtubes clear	VWR Scientific	10011-742	Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube	VWR Scientific	53283-800	Reconstitution glass tubes
Zetasizer	Malvern		DLS