Un ensayo basado en la fluorescencia de fosfolípido escramblasa Actividad

Summary

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Abstract

Scramblases translocan fosfolípidos través de la bicapa de membrana bidireccionalmente de una manera independiente de ATP. La primera escramblasa a ser identificado y bioquímicamente verificada fue opsina, la apoproteína de la rodopsina de los fotorreceptores. La rodopsina es un receptor acoplado a proteína G localizados en las membranas de disco varilla de fotorreceptores de la retina donde es responsable de la percepción de la luz. Actividad escramblasa de rodopsina no depende de su ligando 11- cis retinal, es decir, la opsina apoproteína también es activo como un escramblasa. Aunque fosfolípido constitutiva y regulada de aleatorización jugar un papel importante en la fisiología celular, sólo unos pocos scramblases fosfolípidos han sido identificados hasta el momento, además de opsina. Aquí se describe un ensayo basado en la fluorescencia de la actividad escramblasa de opsina. Opsina se reconstituye en grandes liposomas unilamelares compuestos de fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol y una cantidad traza de fluorescencia NBD marcado con PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) amino] hexanoil} – sn -glicero-3-fosfocolina). actividad escramblasa se determina midiendo el grado en que las moléculas de NBD-PC situados en la cara interna de la vesícula son capaces de acceder a la cara externa, donde su fluorescencia se elimina químicamente por un agente reductor que no pueden atravesar la membrana. Los métodos que describimos tienen aplicabilidad general y se pueden utilizar para identificar y caracterizar las actividades escramblasa de otras proteínas de membrana.

Introduction

La rodopsina fotorreceptor, una proteína G-receptor acoplado prototípico (revisado por ejemplo en la referencia ^1), es la primera escramblasa fosfolípido ser identificados y bioquímicamente verificada ^2,3. Scramblases son transportadores de fosfolípidos que aumentan la tasa intrínsecamente lenta de transbilayer movimiento fosfolípido a fisiológicamente niveles apropiados en un bidireccional, de manera independiente de ATP ^4-6. Ejemplos de sus acciones se pueden encontrar en el retículo endoplásmico y la membrana citoplasmática bacteriana donde aleatorización constitutiva se necesita para la homeostasis de la membrana y el crecimiento, así como para una variedad de vías de glicosilación ^5. Se necesita fosfolípido regulada aleatorización para exponer la fosfatidilserina (PS) en la superficie de las células apoptóticas, donde actúa como un "comer-me" -señal de macrófagos ⁷ y proporciona una superficie procoagulante de las plaquetas sanguíneas activadas para catalizar la producción de la proteína factors es necesario para la coagulación de la sangre. En las membranas de disco fotorreceptoras, la actividad de aleatorización de la rodopsina se ha sugerido para contrarrestar el desequilibrio de fosfolípidos entre las dos valvas de membrana de la bicapa que se genera por el dependiente de ATP, de lípidos unidireccional flipasa ABCA4 ^{4,8,9 10-12.}

A pesar de la importancia fisiológica de scramblases, su identidad sigue siendo difícil hasta la rodopsina se informó como un escramblasa en discos fotorreceptoras ^2, los miembros de la familia de proteínas TMEM16 fueron identificados como Ca ²⁺ scramblases dependientes necesarios para la exposición de PS en la membrana plasmática (revisado en referencia ^13), y se propuso la proteína bacteriana FtsW como escramblasa requiere un lípido II para la síntesis de peptidoglicano ^14. Estos descubrimientos se basan en la reconstitución de proteínas purificadas en liposomas y la demostración de la actividad escramblasa en los proteoliposomas resultantes utilizando la metodología described aquí. Otros posibles scramblases ^15-21 – las proteínas MurJ y AMJ implicados en la biosíntesis del peptidoglicano, WzxE y proteínas relacionadas implicadas en la codificación precursores de antígeno O, proteínas MPRF necesario para trasladar fosfatidilglicerol aminoacylated través de la membrana citoplasmática bacteriana, y miembros de la familia Xkr8 que se han propuesto para exponer PS en la superficie de las células apoptóticas – permanecen a ensayar bioquímicamente. Esto pone de relieve la importancia de un sólido ensayo para identificar y caracterizar la actividad escramblasa.

A continuación, describimos la reconstitución de la opsina purificada, la apoproteína de la rodopsina de los fotorreceptores, en grandes vesículas unilaminares (LUVs), y posterior análisis de la actividad escramblasa en los proteoliposomas resultantes utilizando un ensayo basado en fluorescencia. Hay varios protocolos bien descrita en la literatura disponibles para la expresión heteróloga y la purificación de la opsina, por lo tanto, no lo harádescribirla en este protocolo; utilizamos los protocolos descritos en Goren et al. ³ que el rendimiento de FLAG-etiquetados, opsina termoestable a aproximadamente 100 ng / l en 0,1% (w / v) dodecilmaltósido (DDM).

La reconstitución se consigue mediante el tratamiento de LUVs con detergente suficiente para que se hinchan pero no se disuelven. En estas condiciones, una proteína de membrana – se suministra en forma de micelas de proteína-detergente – integrará en los liposomas y llegar a ser reconstituido en la membrana del liposoma después de la retirada de detergente, lo que resulta en proteoliposomas. Para reconstituir la opsina (obtenida como una proteína purificada en 0.1% (w / v) DDM), LUVs se preparan a partir de una mezcla de POPC (1-palmitoil-2-oleoil- sn -glicero-3-fosfocolina) y POPG (1- palmitoil-2-oleoil- sn -glicero-3- [fosfo-rac- (1-glicerol)]) y se saturó con DDM antes de añadir la opsina y NBD-PC. El detergente se elimina a continuación mediante tratamiento de la muestra con perlas de poliestireno.

<p c lass = "jove_content"> El principio subyacente del ensayo basado en la fluorescencia se muestra en la Figura 1B. LUVs son simétricamente reconstituirse con una cantidad traza de NBD-PC u otro reportero fosfolípido fluorescente marcado con NBD (Figura 1A). En la adición de ditionito, un no fluorescente dianión membrana impermeable, las moléculas de NBD-PC en el prospecto exterior de las LUVs se representan como el nitro-grupo de NBD se reduce a un grupo amino no fluorescente. Como ni moléculas NBD-PC ni ditionito son capaces de atravesar la membrana en la escala de tiempo del experimento (<10 min), esto se traduce en la reducción de 50% de la señal fluorescente. Sin embargo, si los liposomas se reconstituyen con un escramblasa, las moléculas de NBD-PC en el prospecto interior pueden codificar rápidamente hacia el exterior en el que se reducen. Esto resulta en la pérdida total de la fluorescencia en el caso ideal (Figura 1C).

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. Figura 1: Representación esquemática del ensayo de actividad escramblasa El ensayo utiliza un fluorescente reportero lípidos NBD-marcado; Se muestra NBD-PC (A). Grandes vesículas unilamelares se reconstituyen con una cantidad traza de NBD-PC. La reconstitución produce vesículas simétricas, con NBD-PC distribuido por igual en los folletos exterior e interior. Ditionito (S ₂ O ₄ ^2-) reduce químicamente el grupo nitro de NBD a un grupo amino no fluorescente. El tratamiento de los liposomas libres de proteínas con ditionito (B, arriba) provoca una reducción del 50% de la fluorescencia, ya que sólo las moléculas de NBD-PC en el exterior prospecto se reducen: ditionito está cargado negativamente y no puede atravesar la membrana para reaccionar con las moléculas de NBD-PC en el prospecto interior. Tratamiento ditionito de proteoliposomas que contiene opsina-(b, abajo), es decir, proteoliposomas escramblasa-activa, da como resultado la pérdida del 100% de la fluorescence como opsina facilita el movimiento del NBD-PC entre el interior y el exterior prospecto. (C) muestra trazas de fluorescencia idealizadas obtenidos en el tratamiento de los liposomas libres de proteínas y proteoliposomas que contiene opsina-con ditionito. La tasa de pérdida de fluorescencia es la misma en ambos casos que indican que la reducción química de NBD por ditionito es limitante de la velocidad, y que de aleatorización se produce a una velocidad igual o mayor que la velocidad de la reacción química. Las huellas obtenidas a partir de un experimento real se muestran en la Figura 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los métodos que describimos se pueden utilizar para reconstituir y el ensayo de otras proteínas purificadas, así como mezclas de proteínas de membrana obtenidos, por ejemplo, mediante la extracción de microsomas con detergente ^22.

Protocol

1. Preparación de liposomas y proteoliposomas formación de liposomas Usando una jeringa de vidrio, añadir 1.435 POPC l (25 mg / ml, en cloroformo) y 160 POPG l (25 mg / ml, en cloroformo) a un matraz de fondo redondo para obtener 52,5 mol lípidos en una relación molar de POPC: POPG = 9: 1. Secar los lípidos de 30 min usando un evaporador rotatorio a una velocidad de rotación de 145 rpm (no se necesita baño de agua para este volumen de disolvente), a continuación, transferir el matr…

Representative Results

Se describe la reconstitución de la opsina en LUVs para caracterizar su actividad escramblasa usando un ensayo basado en fluorescencia. Se analizan los resultados para establecer un límite inferior de la tasa de fosfolípidos mediada opsina codificación y para determinar el estado en el que oligomérica opsina reconstituye funcionalmente en las vesículas. Para identificar las condiciones óptimas de la reconstitución, es …

Discussion

El ensayo de actividad escramblasa nos permitió originalmente para determinar que la opsina tiene actividad escramblasa fosfolípido ^2. El ensayo también nos permitió caracterizar la actividad escramblasa de opsina por evaluación de la especificidad (se utilizó una variedad de lípidos reportero marcados con NBD tales como NBD-fosfatidiletanolamina, marcado con NBD en una cadena de acilo como se muestra para NBD-PC en la Figura 1A, o en el grupo de cabeza, NBD-esfingomielina o NBD- fosfa…

Materials

1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850457C	POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	840457C	POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-an-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	810130C	NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid	VWR Scientific	EM-5330	HEPES
NaCl	Sigma	S7653-1KG	NaCl
Dodecyl-β-d-maltoside	Anatrace	D310 5 GM	DDM
Fluorimeter cuvettes	sigma	C0918-100EA	cuvettes
Spectrofluorometer	Photon Technology International, Inc.		fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85%	Sigma	157953-5G	dithionite
GraphPad Prism 5 software			Prism
Tris Base	VWR	JTX171-3	Tris
LIPEX 10 mL extruder	Northern Lipids, Inc.		Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm	Sigma	28156-243	Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110607	400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110606	200 nm membrane
sodium phosphate	Sigma	S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13×100 mm	VWR Scientific	47729-572	glass tubes
Perchloric acid	Sigma	30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Sigma	A-7302	ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma	A7631-25G	sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents	Bio Rad	1523920	polystyrene beads
2.0 mL Microtubes clear	VWR Scientific	10011-742	Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube	VWR Scientific	53283-800	Reconstitution glass tubes
Zetasizer	Malvern		DLS