Een fluorescentie-gebaseerde test fosfolipide scramblase Activity
Summary
We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.
Abstract
Scramblases verplaatsen fosfolipiden over het membraan bilaag bidirectioneel in een ATP-onafhankelijke wijze. De eerste scramblase worden geïdentificeerd en biochemisch geverifieerd werd Opsin, de apo-eiwit van de fotoreceptor rhodopsine. Rhodopsine is een G-eiwit-gekoppelde receptor gelokaliseerd staaf fotoreceptor disc membranen van het netvlies waar het verantwoordelijk is voor de waarneming van licht. Rhodopsin's scramblase activiteit hangt niet af van zijn ligand 11- cis -retinal, dat wil zeggen, de apoproteïne opsin is ook actief als scramblase. Hoewel constitutief en gereguleerd fosfolipide versluiering een belangrijke rol spelen celfysiologie, slechts enkele fosfolipide scramblases dusver naast opsin geïdentificeerd. Hier beschrijven we een fluorescentie-gebaseerde test van scramblase activiteit opsin's. Opsin wordt opgelost in grote unilamellaire liposomen samengesteld uit fosfatidylcholine, fosfatidylglycerol en een spoor hoeveelheid fluorescent-NBD gelabelde PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazool-4-yl) amino] hexanoyl} – sn-glycero-3-fosfocholine). Scramblase activiteit wordt bepaald door de mate waarin NBD-PC moleculen in het binnenste leaflet van de vesicle in staat om de buitenste laag waar hun fluorescentie chemisch wordt geëlimineerd door een reductiemiddel dat het membraan niet kan passeren. De werkwijzen beschrijven we hebben algemene toepasbaarheid en kunnen worden gebruikt om scramblase activiteiten van andere membraaneiwitten identificeren en te karakteriseren.
Introduction
De fotoreceptor rhodopsine, een prototypisch G-eiwit gekoppelde receptor (besproken in bijvoorbeeld referentie 1), is het eerste fosfolipide scramblase worden vastgesteld en geverifieerd biochemisch 2,3. Scramblases zijn fosfolipiden transporters die de intrinsiek langzame transbilayer fosfolipiden beweging te verhogen tot fysiologisch passende niveaus in een bidirectionele, ATP-onafhankelijke wijze 4-6. Voorbeelden van hun acties te vinden in het endoplasmatisch reticulum en bacteriële cytoplasmatische membraan waarbij constitutief versluiering nodig voor membraan homeostase en groei, alsmede voor een verscheidenheid van glycosyleringsroutes 5. Gereguleerd fosfolipide versluiering nodig om fosfatidylserine (PS) op het oppervlak van apoptotische cellen bloot waar het als een "eet-me" -signaal voor macrofagen en 7 verschaft een procoagulant oppervlak op geactiveerde bloedplaatjes tot de productie van eiwit factor katalyserens die nodig zijn voor de bloedstolling. In fotoreceptor disc membranen heeft scrambling activiteit rhodopsine is voorgesteld om het fosfolipide onbalans tussen de twee membraanlagen folders van de bilaag die wordt gegenereerd door de ATP-afhankelijke unidirectionele lipide tegen flippase ABCA4 4,8,9 10-12.
Ondanks het fysiologische belang van scramblases, hun identiteit ongrijpbaar gebleven tot rhodopsine werd gerapporteerd als scramblase in fotoreceptor schijven 2, leden van de eiwitfamilie TMEM16 geïdentificeerd als Ca2 + -afhankelijke scramblases nodig voor PS blootstelling bij de plasmamembraan (besproken in referentie 13), en de bacteriële eiwit FtsW voorgesteld als een lipide II scramblase vereist peptidoglycaansynthese 14. Deze ontdekkingen zijn gebaseerd op de reconstitutie van gezuiverde eiwitten in liposomen en demonstratie van scramblase activiteit in de verkregen proteoliposomen hand van de methode describHier ed. Andere potentiële scramblases 15-21 – de MurJ en AMJ eiwitten die betrokken zijn bij de biosynthese van peptidoglycaan, WzxE en verwante eiwitten betrokken bij scrambling O-antigen voorlopers, MPRF eiwit nodig om aminogeacyleerde phosphatidylglycerol verplaatsen over het bacteriële cytoplasma membraan en Xkr8 familieleden die zijn voorgesteld bloot PS op het oppervlak van apoptotische cellen – nog moeten biochemisch testen. Dit benadrukt het belang van een robuuste test te identificeren en te karakteriseren scramblase activiteit.
Hier beschrijven we de bereiding van gezuiverde opsin het apo-eiwit van de fotoreceptor rhodopsine, in grote unilamellaire vesikels (LUV's) en daaropvolgende analyse van scramblase activiteit in de verkregen proteoliposomen met een op fluorescentie gebaseerde assay. Er zijn verscheidene goed beschreven protocols beschikbaar in de literatuur voor de heterologe expressie en zuivering van opsin, daarom zullen wij nietbeschrijven in dit protocol; We gebruiken het in Goren et al. 3 beschreven protocollen die FLAG-gemerkte, thermostabiel opsin levert ongeveer 100 ng / ul in 0,1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM).
Reconstitutie wordt bereikt door behandeling LUVs voldoende wasmiddel zodat zij zwellen maar niet oplossen. Onder deze omstandigheden, een membraaneiwit – in de vorm van eiwit-detergens micellen meebrengen – te integreren in de liposomen en wordt opgelost in de liposoommembraan na verwijdering detergens, waardoor proteoliposomen. Opsin te reconstitueren (verkregen als een gezuiverd eiwit in 0,1% (w / v) DDM), worden LUV's bereid uit een mengsel van POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine) en POPG (1- palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- [fosfo-rac- (1-glycerol)]) en verzadigd met DDM voor het toevoegen opsin en NBD-PC. Daarna wordt het detergens verwijderd door behandelen van het monster met polystyreen korrels.
<p c lass = "jove_content"> Uitgangspunt van de fluorescentie-gebaseerde test wordt getoond in figuur 1B. LUV symmetrisch gereconstitueerd met een sporenhoeveelheid NBD-PC of andere NBD-gelabelde fluorescente fosfolipide reporter (Figuur 1A). Het toevoegen dithioniet, is een membraan-impermeant dianion, NBD-PC moleculen in de buitenste laag van de LUV's worden weergegeven niet fluorescerende als de nitro-groep NBD tot een niet-fluorescerende aminogroep. Aangezien noch NBD-PC moleculen of dithioniet kunnen migreren door de op de tijdschaal van het experiment (<10 min) resulteert in 50% reductie van het fluorescentiesignaal. Indien de liposomen worden gereconstitueerd met een scramblase, NBD-PC moleculen in het binnenste leaflet kan snel scramble naar buiten waar zij worden gereduceerd. Dit resulteert in het totale verlies van fluorescentie in het ideale geval (figuur 1C).es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
. Figuur 1: Schematische weergave van de scramblase activiteit assay De assay maakt gebruik van een fluorescent-gelabelde reporter NBD lipide; NBD-PC is afgebeeld (A). Grote unilamellaire blaasjes gereconstitueerd met een sporenhoeveelheid NBD-PC. Reconstitutie produceert symmetrische blaasjes met NBD-PC gelijk verdeeld in de buitenste en binnenste folders. Dithioniet (S 2 O 4 2-) chemisch reduceert de nitro-groep NBD een niet-fluorescerende aminogroep. Behandeling van eiwitvrije liposomen met dithioniet (B, boven) veroorzaakt een reductie 50% van de fluorescentie omdat alleen het NBD-PC moleculen in de buitenste laag gereduceerd: dithioniet is negatief geladen en kan het membraan reageren met NBD-PC moleculen niet overschrijden in het binnenste leaflet. Dithioniet behandeling van opsin bevattende proteoliposomen (B, onder), dat wil zeggen, scramblase-actieve proteoliposomen, resulteert in 100% verlies van fluorescence als opsin vergemakkelijkt beweging van NBD-PC tussen de binnenste en de buitenste laag. (C) toont geïdealiseerde fluorescentie sporen verkregen op de behandeling van eiwitvrije liposomen en-opsin bevattende proteoliposomen met dithioniet. De snelheid van fluorescentie verlies is hetzelfde in beide gevallen aangeeft dat de chemische reductie van NBD door dithioniet is snelheidsbeperkende, en dat klauteren gebeurt met een snelheid die gelijk is aan of groter is dan de snelheid van de chemische reactie. Sporen verkregen uit een eigenlijke experiment zijn weergegeven in figuur 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De werkwijzen beschrijven we kunnen worden gebruikt voor het reconstitueren en andere testen gezuiverde eiwitten, alsmede mengsels van membraaneiwitten verkregen, bijvoorbeeld door extractie met detergens microsomen 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
De scramblase activiteit test konden we oorspronkelijk om te bepalen dat opsin heeft fosfolipiden scramblase activiteit 2. De test konden we ook opsin's scramblase activiteit karakteriseren testen specificiteit (we gebruikten verschillende NBD-gelabelde reporter lipiden zoals NBD-fosfatidylethanolamine, gelabeld met NBD op acylketen zoals getoond NBD-PC in figuur 1A, of de kopgroep, NBD-sfingomyeline of NBD- fosfatidylserine 2) het effect van vesicle lipidesamenstelling (bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) and the Austrian Science Fund (FWF) project J3686 (B.P.).
Materials
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840457C | POPG |
| 1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-an-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 810130C | NBD-PC |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid | VWR Scientific | EM-5330 | HEPES |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | NaCl |
| Dodecyl-β-d-maltoside | Anatrace | D310 5 GM | DDM |
| Fluorimeter cuvettes | sigma | C0918-100EA | cuvettes |
| Spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. | fluorimeter | |
| Sodium hydrosulfite technical grade, 85% | Sigma | 157953-5G | dithionite |
| GraphPad Prism 5 software | Prism | ||
| Tris Base | VWR | JTX171-3 | Tris |
| LIPEX 10 mL extruder | Northern Lipids, Inc. | Extruder | |
| Whatman, Drain disc, PE, 25 mm | Sigma | 28156-243 | Disc support |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110607 | 400 nm membrane |
| Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter | Sigma | WHA110606 | 200 nm membrane |
| sodium phosphate | Sigma | S3264-500G | |
| VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13×100 mm | VWR Scientific | 47729-572 | glass tubes |
| Perchloric acid | Sigma | 30755-500ML | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma | A-7302 | ammonium molybdate |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma | A7631-25G | sodium ascorbate |
| Bio-Beads SM2 adsorbents | Bio Rad | 1523920 | polystyrene beads |
| 2.0 mL Microtubes clear | VWR Scientific | 10011-742 | Reconstitution tubes |
| Reconstitution glass tube | VWR Scientific | 53283-800 | Reconstitution glass tubes |
| Zetasizer | Malvern | DLS | |
References
- Ernst, O. P., et al. Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
- Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).
- Goren, M. A., et al. Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor. Nat. Commun. 5, 5115 (2014).
- Ernst, O. P., Menon, A. K. Phospholipid scrambling by rhodopsin. Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).
- Sanyal, S., Menon, A. K. Flipping lipids: why an’ what’s the reason for?. ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).
- Bevers, E. M., Williamson, P. L. Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).
- Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).
- Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer. Nat. Commun. 3, 925 (2012).
- Quazi, F., Molday, R. S. ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).
- Ben-Shabat, S., et al. Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).
- Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids. J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).
- Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions. J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).
- Mohammadi, T., et al. Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane. EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).
- Meeske, A. J., et al. MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).
- Ruiz, N. Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis. Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).
- Rick, P. D., et al. Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen. J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).
- Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis. J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).
- Suzuki, J., Nagata, S. Phospholipid scrambling on the plasma membrane. Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).
- Alaimo, C., et al. Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO J. 25, 967-976 (2006).
- Ernst, C. M., Peschel, A. Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids. Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).
- Vehring, S., et al. Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins. Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).
- Rouser, G., et al. Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5, 494-496 (1970).
- Rigaud, J. -. L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).
- Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).
- Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside. Biochemistry. 20, 833-840 (1981).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nat. Commun. 4, 2367 (2013).
- Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids. Biochem. J. 389, 517-526 (2005).
- Marek, M., Günther-Pomorski, T. Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives. Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).
- Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes. J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).
- Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport. Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).
- Romsicki, Y., Sharom, F. J. Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter. Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).
- Zhou, X., Graham, T. R. Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).
