Ein Fluoreszenz-basierte Assay von Phospholipid Scramblase Activity

Summary

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Abstract

Scramblases transloziert Phospholipiden durch die Membran-Doppelschicht in zwei Richtungen in einer ATP-unabhängige Art und Weise. Die erste scramblase werden identifiziert und biochemisch wurde Opsin prüft, das Apoprotein des Photorezeptors Rhodopsin. Rhodopsin ist ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor in Stabphotorezeptor Scheibenmembranen der Retina lokalisiert, wo es für die Wahrnehmung von Licht verantwortlich ist. Rhodopsin der Scramblase Aktivität nicht auf seinem Liganden abhängt 11- cis – Retinal, das heißt, das Apoprotein Opsin ist auch aktiv als Scramblase. Obwohl die konstitutive und reguliert Scrambling Phospholipid eine wichtige Rolle in der Zellphysiologie zu spielen, nur wenige Phospholipid scramblases wurden bisher neben Opsin identifiziert. Hier beschreiben wir ein Fluoreszenz-basierten Assay von Scramblase Aktivität des Opsin. Opsin rekonstituiert in große unilamellare Liposomen aus Phosphatidylcholin, Phosphatidylglycerin und eine Spurenmenge an fluoreszierenden NBD-markierten PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino] hexanoyl} – sn – glycero-3-phosphocholin). Scramblase Aktivität wird durch Messen der Größe der auf dem NBD-PC-Moleküle in dem inneren Blatt des Vesikels befindet sind in der Lage die äußere Faltblatt zuzugreifen, wo ihre Fluoreszenz chemisch durch ein Reduktionsmittel eliminiert wird, die die Membran nicht passieren kann. Die Methoden, die wir haben eine allgemeine Anwendbarkeit beschreiben und kann verwendet werden, Scramblase Aktivitäten anderer Membranproteine ​​zu identifizieren und zu charakterisieren.

Introduction

Der Photorezeptor Rhodopsin, eine prototypische G – Protein-gekoppelten Rezeptor (beispielsweise in Bezug Bewertung ¹⁾ ist das erste Phospholipid scramblase werden identifiziert und biochemisch verifiziert ^2,3. Scramblases sind Phospholipid – Transporter, die die eigen langsamen Geschwindigkeit von Transdoppel Phospholipid Bewegung physiologisch geeigneten Ebenen in einem bidirektionalen, ATP-unabhängige Weise ^4-6 erhöhen. Beispiele für ihre Aktionen können im endoplasmatischen Retikulum und bakterielle Cytoplasmamembran zu finden, wo die konstitutive Scrambling für Membran – Homöostase und Wachstum notwendig ist, aber auch für eine Vielzahl von Glycosylierungswege ^5. Reguliert Phospholipid Verwürfelung benötigt Phosphatidylserin (PS) auf der Oberfläche von apoptotischen Zellen zu belichten , wo es als ein "eat-me" -Signal für Makrophagen ⁷ und stellt eine prokoagulierende Oberfläche auf aktivierten Blutplättchen die Bildung von Proteinfaktor zu katalysierens für die Blutgerinnung benötigt. In Photorezeptorscheibenmembranen hat Scrambling Aktivität des Rhodopsin vorgeschlagen worden , das Phospholipid Ungleichgewicht zwischen den beiden Membran Blättchen der Bilayer entgegenzuwirken , die durch den ATP-abhängigen, unidirektionale Lipid erzeugt wird Flippase ABCA4 ^{4,8,9 10-12.}

Trotz der physiologischen Bedeutung von scramblases, ihre Identität blieb schwer bis Rhodopsin als Scramblase in Photorezeptor Scheiben berichtet wurde ^2, die Mitglieder des TMEM16 Proteinfamilie wurden als Ca ²⁺ identifiziert -abhängigen scramblases für PS – Exposition an der Plasmamembran benötigt (in Bezug prüft ¹³⁾ und das bakterielle Protein FTSW wurde vorgeschlagen , wie ein Lipid II für Peptidoglycansynthese ¹⁴ erforderlich Scramblase. Diese Entdeckungen wurden basierend auf der Rekonstitution von gereinigten Proteinen in Liposomen und Demonstration scramblase Aktivität in den resultierenden Proteo die Methodik describ Verwendunghier ed. Andere potenzielle scramblases ^15-21 – die MurJ und amj Proteine ​​in Peptidoglycan – Biosynthese beteiligt, WzxE und verwandte Proteine ​​verwickelt in Scrambling O-Antigen – Vorläufer, MPRF Protein benötigt aminoacylierten Phosphatidylglycerin über die bakterielle Cytoplasmamembran zu translozieren und Xkr8 Familienmitglieder , die vorgeschlagen wurden , PS auf der Oberfläche von apoptotischen Zellen zu belichten – bleiben biochemisch getestet werden. Dies unterstreicht die Bedeutung eines robusten Assays zu identifizieren und Scramblase Aktivität zu charakterisieren.

Hier beschreiben wir die Rekonstitution von gereinigten Opsin, das Apoprotein des Photorezeptors Rhodopsin, in große unilamellare Vesikel (LUVs) und anschließende Analyse der scramblase Aktivität in den resultierenden Proteo eine fluoreszenzbasierten Assay. Es gibt mehrere gut beschriebenen Protokolle in der Literatur für die heterologe Expression und Reinigung von Opsin, deshalb werden wir nichtbeschreiben sie in diesem Protokoll; wir verwenden , um die in Goren beschriebenen Protokolle et al. ³ , die bei etwa 100 ng / & mgr; l in 0,1% (w / v) Dodecylmaltosid (DDM) FLAG-markiertes, thermo Opsin ergibt.

Die Rekonstitution wird durch die Behandlung LUVs mit ausreichend Waschmittel erreicht, so dass sie anschwellen, aber nicht lösen. Unter diesen Bedingungen wird ein Membranprotein – in Form von Protein-Mizellen Detergenz zugeführt – werden in die Liposomen zu integrieren und in die Liposomenmembran nach Entfernung des Detergens rekonstituiert geworden in Proteo führt. Zu rekonstituieren Opsin (als gereinigtes Protein erhalten in 0,1% (w / v) DDM) sind LUVs aus einem Gemisch aus POPC hergestellt (1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn – glycero-3-phosphocholin) und POPG (1- Palmitoyl-2-Oleoyl – sn – glycero-3- [phospho-rac- (1-Glycerin)]) und mit DDM gesättigt vor dem Hinzufügen von Opsin und NBD-PC. Das Detergens wird dann durch Behandlung der Probe mit Polystyrolkügelchen entfernt.

<p c lass = "jove_content"> Das Prinzip der Fluoreszenz basierenden Assay zugrundeliegende Aufgabe wird in 1B gezeigt. LUVs sind symmetrisch mit einer Spurenmenge von NBD-PC oder andere NBD-markierte fluoreszierende Phospholipid reporter (1A) rekonstituiert. Bei Zugabe von Dithionit, eine Membran-impermeablen Dianion, NBD-PC-Moleküle in dem äußeren Blatt der LUVs gerendert nichtfluoreszierenden als nitro-Gruppe von NBD ist mit einem nicht-fluoreszierenden Amino-Gruppe reduziert. Da weder NBD-PC-Moleküle noch Dithionit Lage sind, die Membran auf der Zeitskala des Versuchs (<10 min) zu durchlaufen, ergibt dies 50% ige Reduktion des Fluoreszenzsignals. schnell nach außen kann jedoch, wenn die Liposomen mit einem scramblase, NBD-PC-Moleküle in der inneren Faltblatt rekonstituiert werden verwürfeln, wo sie reduziert sind. Daraus ergibt sich der Gesamtverlust der Fluoreszenz im idealen Fall (Abbildung 1C).

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. Abbildung 1: Schematische Darstellung des Scramblase Aktivitätstest Der Test verwendet eine fluoreszierende NBD-markierten Reporter Lipid; NBD-PC angezeigt wird (A). Große unilamellare Vesikel sind mit einer Spurenmenge von NBD-PC rekonstituiert. Rekonstitution erzeugt symmetrischen Vesikeln mit NBD-PC gleichmäßig verteilt in den äußeren und inneren Blättchen. Dithionit (S ₂ O ₄ ^2-) reduziert chemisch die Nitrogruppe von NBD zu einem nicht-fluoreszierenden amino-Gruppe. Die Behandlung von proteinfreien Liposomen mit Dithionit (B, oben) bewirkt eine 50% ige Reduktion der Fluoreszenz , da nur die NBD-PC – Moleküle in der äußeren Leaflet reduziert: Dithionit negativ geladen ist und die Membran nicht überqueren können mit NBD-PC – Moleküle reagieren im inneren Blatt. Dithionit Behandlung von Opsin haltigen Proteo (B, unten), dh scramblase aktive Proteo, Ergebnisse in 100% Verlust der fluorescence als Opsin erleichtert die Bewegung von NBD-PC zwischen dem inneren und dem äußeren Faltblatt. (C) zeigt idealisierte Fluoreszenzspuren erhalten bei der Behandlung von proteinfreien Liposomen und Opsin haltigen Proteo mit Dithionit. Die Geschwindigkeit der Fluoreszenzverlust ist die gleiche in beiden Fällen das anzeigt, dass die chemische Reduktion von NBD von Dithionit ist geschwindigkeitsbestimmend, und das Verwürfeln bei einer Geschwindigkeit gleich oder größer ist als die Geschwindigkeit der chemischen Reaktion auftritt. Spuren von einem tatsächlichen Experiment sind in Abbildung 3 dargestellt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Methoden , die wir beschreiben , können verwendet werden , um andere gereinigten Proteine ​​zu rekonstituieren und Assay sowie Mischungen von Membranproteinen erhalten werden , beispielsweise durch Mikrosomen mit Waschmittel ²² zu extrahieren.

Protocol

1. Herstellung von Liposomen und Proteoliposomen Liposome Formation Verwendung einer Glasspritze, fügen 1.435 ul POPC (25 mg / ml, in Chloroform) und 160 & mgr; l POPG (25 mg / ml, in Chloroform) auf einen Rundkolben wurden 52,5 umol Lipide in einem Molverhältnis POPC zu erhalten: POPG = 9: 1. Trocknen der Lipide für 30 min unter Verwendung eines Rotationsverdampfer bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 145 rpm (kein Wasserbad wird für dieses Volumen an Lösungsmittel erforderlich)…

Representative Results

Wir beschreiben die Rekonstitution von Opsin in LUVs unter Verwendung eines fluoreszenzbasierten Assays seiner Scramblase Aktivität zu charakterisieren. Wir analysieren die Ergebnisse eine untere Grenze auf die Geschwindigkeit des Opsin-vermittelten Phospholipid zu platzieren Scrambling und die oligomere Zustand zu bestimmen, in dem Opsin funktionell in den Vesikeln rekonstituiert. Um eine optimale Rekonstituierung Bedingunge…

Discussion

Die Scramblase Aktivitätstest konnten wir ursprünglich das Opsin Phospholipid Scramblase zu bestimmen Aktivität ² hat. Der Assay auch erlaubt uns Opsin der scramblase Aktivität zu charakterisieren , indem die Spezifität zu testen (verwendeten wir eine Vielzahl von NBD-markierten Reporter Lipiden wie NBD-Phosphatidylethanolamin, mit NBD an einer Acylkette markiert , wie für NBD-PC in Figur 1A gezeigt ist , oder auf die Kopfgruppen-, NBD-Sphingomyelin oder NBD- Phosphatidylserin ^2),<…

Materials

1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850457C	POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	840457C	POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-an-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	810130C	NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid	VWR Scientific	EM-5330	HEPES
NaCl	Sigma	S7653-1KG	NaCl
Dodecyl-β-d-maltoside	Anatrace	D310 5 GM	DDM
Fluorimeter cuvettes	sigma	C0918-100EA	cuvettes
Spectrofluorometer	Photon Technology International, Inc.		fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85%	Sigma	157953-5G	dithionite
GraphPad Prism 5 software			Prism
Tris Base	VWR	JTX171-3	Tris
LIPEX 10 mL extruder	Northern Lipids, Inc.		Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm	Sigma	28156-243	Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110607	400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110606	200 nm membrane
sodium phosphate	Sigma	S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13×100 mm	VWR Scientific	47729-572	glass tubes
Perchloric acid	Sigma	30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Sigma	A-7302	ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma	A7631-25G	sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents	Bio Rad	1523920	polystyrene beads
2.0 mL Microtubes clear	VWR Scientific	10011-742	Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube	VWR Scientific	53283-800	Reconstitution glass tubes
Zetasizer	Malvern		DLS