Ein Fluoreszenz-basierte Assay von Phospholipid Scramblase Activity

Zusammenfassung

Wir beschreiben einen fluoreszenzbasierten Assay zur Messung von Phospholipid-Scrambling in großen unilamellären Liposomen, die mit Opsin rekonstituiert wurden.

Zusammenfassung

Scramblases transloziert Phospholipiden durch die Membran-Doppelschicht in zwei Richtungen in einer ATP-unabhängige Art und Weise. Die erste scramblase werden identifiziert und biochemisch wurde Opsin prüft, das Apoprotein des Photorezeptors Rhodopsin. Rhodopsin ist ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor in Stabphotorezeptor Scheibenmembranen der Retina lokalisiert, wo es für die Wahrnehmung von Licht verantwortlich ist. Rhodopsin der Scramblase Aktivität nicht auf seinem Liganden abhängt 11- cis - Retinal, das heißt, das Apoprotein Opsin ist auch aktiv als Scramblase. Obwohl die konstitutive und reguliert Scrambling Phospholipid eine wichtige Rolle in der Zellphysiologie zu spielen, nur wenige Phospholipid scramblases wurden bisher neben Opsin identifiziert. Hier beschreiben wir ein Fluoreszenz-basierten Assay von Scramblase Aktivität des Opsin. Opsin rekonstituiert in große unilamellare Liposomen aus Phosphatidylcholin, Phosphatidylglycerin und eine Spurenmenge an fluoreszierenden NBD-markierten PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino] hexanoyl} - sn - glycero-3-phosphocholin). Scramblase Aktivität wird durch Messen der Größe der auf dem NBD-PC-Moleküle in dem inneren Blatt des Vesikels befindet sind in der Lage die äußere Faltblatt zuzugreifen, wo ihre Fluoreszenz chemisch durch ein Reduktionsmittel eliminiert wird, die die Membran nicht passieren kann. Die Methoden, die wir haben eine allgemeine Anwendbarkeit beschreiben und kann verwendet werden, Scramblase Aktivitäten anderer Membranproteine ​​zu identifizieren und zu charakterisieren.

Einleitung

Der Photorezeptor Rhodopsin, eine prototypische G - Protein-gekoppelten Rezeptor (beispielsweise in Bezug Bewertung ¹⁾ ist das erste Phospholipid scramblase werden identifiziert und biochemisch verifiziert ^2,3. Scramblases sind Phospholipid - Transporter, die die eigen langsamen Geschwindigkeit von Transdoppel Phospholipid Bewegung physiologisch geeigneten Ebenen in einem bidirektionalen, ATP-unabhängige Weise ^4-6 erhöhen. Beispiele für ihre Aktionen können im endoplasmatischen Retikulum und bakterielle Cytoplasmamembran zu finden, wo die konstitutive Scrambling für Membran - Homöostase und Wachstum notwendig ist, aber auch für eine V....

Protokoll

1. Herstellung von Liposomen und Proteoliposomen

1. Liposome Formation
   1. Verwendung einer Glasspritze, fügen 1.435 ul POPC (25 mg / ml, in Chloroform) und 160 & mgr; l POPG (25 mg / ml, in Chloroform) auf einen Rundkolben wurden 52,5 umol Lipide in einem Molverhältnis POPC zu erhalten: POPG = 9: 1.
   2. Trocknen der Lipide für 30 min unter Verwendung eines Rotationsverdampfer bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 145 rpm (kein Wasserbad wird für dieses Volumen an Lösungsmittel erforderlich), dann übertragen die Kolben auf einem Vakuum-Exsikkator für mindestens 3 Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur (RT).
   3. Hydratisieren des getrockn....

Ergebnisse

Wir beschreiben die Rekonstitution von Opsin in LUVs unter Verwendung eines fluoreszenzbasierten Assays seiner Scramblase Aktivität zu charakterisieren. Wir analysieren die Ergebnisse eine untere Grenze auf die Geschwindigkeit des Opsin-vermittelten Phospholipid zu platzieren Scrambling und die oligomere Zustand zu bestimmen, in dem Opsin funktionell in den Vesikeln rekonstituiert.

Um eine optimale Rekonstituierung Bedingungen.......

Diskussion

Die Scramblase Aktivitätstest konnten wir ursprünglich das Opsin Phospholipid Scramblase zu bestimmen Aktivität ² hat. Der Assay auch erlaubt uns Opsin der scramblase Aktivität zu charakterisieren , indem die Spezifität zu testen (verwendeten wir eine Vielzahl von NBD-markierten Reporter Lipiden wie NBD-Phosphatidylethanolamin, mit NBD an einer Acylkette markiert , wie für NBD-PC in Figur 1A gezeigt ist , oder auf die Kopfgruppen-, NBD-Sphingomyelin oder NBD- Phosphatidylserin ^2), .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin	Avanti Polare Lipide	850457C	POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (Natriumsalz)	Avanti Polare Lipide	840457C	POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholin	Avanti Polar Lipids	810130C	NBD-PC
4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure	VWR Scientific	EM-5330	HEPES
NaCl	Sigma	S7653-1KG	NaCl
Dodecyl-β-D-Maltosid	Anatrace	D310 5 GM	DDM
Fluorimeter Küvetten	Sigma	C0918-100EA	Küvetten
Spektrofluorometer	Photon Technology International, Inc.	Fluorimeter
Natriumhydrosulfit technische Qualität, 85%	Sigma	157953-5G	Dithionit
GraphPad Prism 5 Software			Prism
Tris Base	VWR	JTX171-3	Tris
LIPEX 10 ml Extruder	Nördliche Lipide, Inc.		Extruder
Whatman, Ablaufscheibe, PE, 25 mm	Sigma	28156-243	Scheibenhalterung
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranen, 0,4 &; Mikro; m, 25 mm	Durchmesser Sigma	WHA110607	400 nm Membran
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0,2 µ m, 25 mm Durchmesser	Sigma	WHA110606	200 nm Membran
Natriumphosphat	Sigma	S3264-500G
VWR Kulturröhrchen, Einweg, Borosilikatglas, 13 x 100 mm	VWR Scientific	47729-572	Glasröhrchen
Perchlorsäure	Sigma	30755-500ML
Ammoniummolybdat Tetrahydrat	Sigma	A-7302	Ammoniummolybdat
(+)-Natrium-L-Ascorbat	Sigma	A7631-25G	Natriumascorbat
Bio-Beads SM2 Adsorptionsmittel	Bio Rad	1523920	Polystyrolkügelchen
2,0 ml Mikroröhrchen klar	VWR Scientific	10011-742	Rekonstitutionsröhrchen
Rekonstitutionsglasröhrchen	VWR Scientific	53283-800	Rekonstitutionsglasröhrchen
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