Phagocytosis के प्रारंभिक दौर Visualizing
Summary
Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.
Abstract
स्तनधारी शरीर तंत्र के विभिन्न परतों कि रोगज़नक़ हमलों से खुद की रक्षा करने में मदद के साथ सुसज्जित है। ऐसे न्यूट्रोफिल, वृक्ष के समान कोशिकाओं, और मैक्रोफेज के रूप में – – प्रतिरक्षा प्रणाली की व्यावसायिक फ़ैगोसाइट का पता लगाने और phagocytosis 1 के माध्यम से इस तरह के हमलावर रोगजनकों स्पष्ट करने के जन्मजात क्षमता बरकरार रहती है। Phagocytosis कोशिका की सतह 2, 3 पर झिल्ली पुनर्गठन और actin remodeling के नृत्य की घटनाओं में शामिल है। Phagocytes सफलतापूर्वक internalize और विदेशी अणुओं उन्मूलन केवल जब phagocytosis के सभी चरणों को पूरा कर रहे हैं। ये कदम मान्यता और पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स द्वारा रोगज़नक़ (PRRS) कोशिका की सतह पर रहने के बंधन में शामिल हैं, actin समृद्ध झिल्लीदार उभार (pseudopods) के माध्यम से phagocytic कप के गठन के कण को चारों ओर, और फेगोसोम का बँटवारा phagolysosome परिपक्वता के द्वारा पीछा किया है कि में परिणामरोगज़नक़ 3, 4 की मौत हो गई।
इमेजिंग और phagocytosis के विभिन्न चरणों की मात्रा का ठहराव इस सेलुलर प्रक्रिया के आणविक तंत्र elucidating के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। वर्तमान पांडुलिपि तरीकों की रिपोर्ट phagocytosis के विभिन्न चरणों का अध्ययन करने के लिए। हम कल्पना और बंधन, phagocytic कप गठन यों तो एक माइक्रोस्कोप आधारित दृष्टिकोण, और phagocytes से कण के internalization का वर्णन है। Phagocytosis रूप में होता है जब phagocytic कोशिकाओं पर सहज रिसेप्टर्स लक्ष्य कण से भी बड़ा 0.5 माइक्रोन, assays हम यहाँ पेश रोगजनक कवक कैंडिडा सफेद और ऐसे zymosan और आईजीजी लिपटे मोतियों के रूप में अन्य विविक्त के उपयोग के समावेश पर ligands मुठभेड़।
Introduction
इस तरह के बैक्टीरिया, वायरस और कवक के रूप में रोगजनकों के लिए निरंतर प्रदर्शन के बावजूद, हमारे शरीर को अच्छी तरह से प्रतिरक्षा तंत्र है कि संक्रमण के खिलाफ संरक्षण प्रदान करने के साथ सुसज्जित है। सहज प्रतिरक्षा प्रणाली पर हमला रोगजनकों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति है और phagocytic कोशिकाओं है कि पहचान और विदेशी लक्ष्यों को भली पर मुख्य रूप से निर्भर करता है।
Phagocytosis एक evolutionarily संरक्षित सेलुलर प्रक्रिया है कि 0.5 माइक्रोन से अधिक अवांछित विविक्त का घिराव शामिल है। Phagocytic कोशिकाओं प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स कोशिका की सतह पर है कि उन्हें रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) घिराव 3 से पहले रोगजनकों पर उपस्थित पहचान करने के लिए सक्षम है (यह भी पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स, PRRS के रूप में जाना जाता है) की एक विस्तृत श्रृंखला व्यक्त करते हैं। पैथोजन बंधन कोशिका की सतह पर रिसेप्टर क्लस्टरिंग द्वारा पीछा किया और एक phagocytic कप के गठन से चलाता है। इस actin संचालित झिल्ली remodeling है कि चारों ओर protrudes में यह परिणामलक्ष्य, अंततः इसे घेर और बन्द रखो बंद एक असतत phagosomal रिक्तिका 2, 5 के रूप में। फेगोसोम तो परिपक्व होती है और देर endosomes और लाइसोसोम कि phagolysosome 6 रूपों के साथ बाद में संलयन द्वारा acidifies।
Phagocytosis रिसेप्टर की मध्यस्थता और actin संचालित घटना के रूप में वर्णन किया गया है हालांकि, इस प्रक्रिया को भी लिपिड, ऐसे phosphoinositides (पीआईएस) और sphingolipids 7, 8 के रूप में है कि प्लाज्मा झिल्ली रचना के स्थानिक अस्थायी संशोधन पर निर्भर करता है। जबकि actin polymerization phagocytic कप के आधार पर phosphoinositol-4,5-biphosphate (पीआई (4,5) पी 2) के एक स्थानीय संचय से निर्धारित होता है, actin depolymerization की (पीआई (4,5) पी रूपांतरण पर निर्भर करता है 2 phosphoinositol-3,4,5-biphosphate करने के लिए (पीआई (3,4,5) पी 3) 3, 9। दोनों संशोधनोंलक्ष्य के आसपास pseudopods और बाद भक्षककोशिकीय 10 की cytosol में कणों की डूब में सक्षम बनाता है सफल विस्तार के लिए पूर्व सुराग के रूप में आवश्यक हैं।
प्रकोष्ठों phagocytose करने की क्षमता है कि या तो पेशेवर फ़ैगोसाइट, मैक्रोफेज / monocytes, granulocytes / न्यूट्रोफिल, और वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) या ऐसे fibroblast और उपकला कोशिकाओं के रूप में 11 गैर-फ़ैगोसाइट, की तरह। सभी फ़ैगोसाइट द्वारा किया जाता phagocytosis, ऊतक के रखरखाव और remodeling में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है, जबकि पेशेवर फ़ैगोसाइट द्वारा किया जाता phagocytosis रोगजनकों के खिलाफ सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के समन्वय के लिए जिम्मेदार है। व्यावसायिक फ़ैगोसाइट केवल अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं लसीकावत् के लिए मौजूद एंटीजन निगल नहीं है और रोगज़नक़ मार, लेकिन यह भी। यह समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स की रिहाई के लिए और लसीकावत् कोशिकाओं की सगाई के लिए योगदान देता है, इसलिए करने के लिए अग्रणीसंक्रमण 12 के सफल नाकाबंदी।
परंपरागत जैव रासायनिक तकनीक ऐसी बाद translational संशोधनों और प्रोटीन के बीच विभिन्न उच्च आत्मीयता संघों के रूप में phagocytosis के दौरान विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं के आणविक तंत्र के बारे में ज्ञान प्राप्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। हालांकि, यह परंपरागत जैव रासायनिक तरीकों का उपयोग कर phagocytic घटनाओं के स्थानिक और लौकिक गतिशीलता के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए मुश्किल है। लाइव सेल इमेजिंग न केवल हमें एक समय संवेदनशील तरीके से सेलुलर घटनाओं पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी एक एकल कोशिका स्तर पर जानकारी हासिल करने के लिए हमें सक्षम बनाता है। यहाँ हम phagocytosis के विभिन्न चरणों की जांच करने के लिए एक विधि का वर्णन है, साथ ही पूरी प्रक्रिया spatiotemporally विश्लेषण करने के लिए confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऐसे मैक्रोफेज और वृक्ष के समान कोशिकाओं, के रूप में पेशेवर फ़ैगोसाइट, अपनी चपेट में ले और रोगजनकों पर हमला इसलिए phagocytosis मेजबान रक्षा प्रणाली का एक महत्वपूर्ण घटक है, जिससे समाप्त। इस प्रक्रिया के दौरान फ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इमेजिंग के लिए एमआईटी के व्हाइटहेड संस्थान में वेंडी सामन और उबकना सुविधा के निकी वाटसन धन्यवाद।
Materials
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Cell Signaling Technology | 9998 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | BP-231-1 | |
| DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium) | Gibco | 11965 | |
| PBS, 1X (Phosphate- Buffered Saline) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | |
| FITC-coupled IgG-coated latex beads | Cayman | 500290 | |
| L-Glutamine 200mM (100X) | ThermoFisher | 25030081 | |
| Paraformaldehyde Solution (4% in PBS) | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Penicillin-streptomycin (10'000U/mL) | ThermoFisher | 15-140-122 | |
| Phalloidin-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute) | Gibco | 61870 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | S7900 | |
| Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS) | Corning cellgro | MT25900CI | |
| Trypsin-EDTA (1X) (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | Z23374 | |
| Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers) | ThermoFisher | 155361 | |
| Glasstic slide 10 with grids | Hycor | 87144 |
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