تصور المراحل المبكرة من البلعمة
Summary
Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.
Abstract
وقد تم تجهيز جسم الثدييات مع طبقات مختلفة من الآليات التي تساعد على الدفاع عن نفسها من الغزوات الممرض. البالعات المهنية للنظام المناعي – مثل العدلات، والخلايا الجذعية، والضامة – تحتفظ القدرة الفطرية لكشف ومسح هذه الجراثيم الغازية من خلال البلعمة 1. تتضمن البلعمة الأحداث فشلت في إعادة تنظيم الغشاء وإعادة الأكتين على سطح الخلية 2 و 3. البالعات استيعاب بنجاح والقضاء على الجزيئات الغريبة فقط عندما يتم استيفاء جميع مراحل البلعمة. وتشمل هذه الخطوات الاعتراف وملزمة من مسببات المرض عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) المقيمين على سطح الخلية، وتشكيل كوب أكلة من خلال نتوءات غشائي التخصيب الأكتين (pseudopods) لتطويق الجسيمات، وانفصال من يبلوع تليها النضج يحلول يبلوعي أن النتائج فيمقتل الممرض 3 و 4.
التصوير النوعي والكمي لمراحل مختلفة من البلعمة هو أساسي لتوضيح الآليات الجزيئية لهذه العملية الخلوية. المخطوطة تقديم تقارير طرق لدراسة مختلف مراحل البلعمة. نحن تصف النهج القائم على المجهر لتصور وتحديد، تشكيل كوب أكلة ملزم، واستيعاب الجسيمات من قبل البالعات. كما تحدث البلعمة عندما مستقبلات الفطرية على الخلايا البلعمية تواجه بروابط على الجسيمات الهدف أكبر من 0.5 ميكرون، والمقايسات نقدم هنا تشمل استخدام الفطريات المسببة للأمراض المبيضات البيض وغيرها من الجسيمات مثل زيموزان وحبات مغلفة مفتش.
Introduction
وعلى الرغم من التعرض المستمر لمسببات الأمراض مثل البكتيريا والفيروسات والفطريات، وأجسامنا مجهزة تجهيزا جيدا مع الآلية المناعية التي توفر الحماية ضد العدوى. نظام المناعة الفطري هو خط الدفاع الأول ضد الجراثيم الغازية ويعتمد أساسا على الخلايا البلعمية التي تعترف واستيعاب اهداف اجنبية.
البلعمة هي عملية الخلوية الحفاظ تطويريا الذي يشمل ابتلاع الجسيمات غير المرغوب فيها أكبر من 0.5 ميكرون. الخلايا البلعمية تعبر عن مجموعة واسعة من مستقبلات المناعة (المعروف أيضا باسم مستقبلات التعرف على الأنماط، PRRs) على سطح الخلية التي تمكنهم من التعرف على الأنماط الجزيئية المرتبطة الممرض (PAMPs) موجودة على مسببات الأمراض قبل الغمر 3. الممرض ويتبع ملزمة من قبل تجمع مستقبلات على سطح الخلية ويطلق تشكيل كوب البلعمة. وهذا يؤدي إلى يحركها الأكتين يعيد الغشاء الذي يبرز حولالهدف، في نهاية المطاف يغلف ذلك ومعسر النعاس، لتشكل منفصلة phagosomal فجوة 2، 5. ويبلوع ثم ينضج والخواص الحمضية الانصهار لاحق مع أواخر الإندوسومات والجسيمات الحالة التي تشكل يحلول يبلوعي 6.
على الرغم من أن يوصف البلعمة كما بوساطة مستقبلات ويحركها الأكتين الحدث، وهذه العملية تعتمد أيضا على تعديل المكانية والزمانية من الدهون التي تشكل غشاء البلازما، مثل phosphoinositides (حزب القانون والعدالة)، والإسفنجية 7 و 8. في حين تمليه البلمرة أكتين من قبل تراكم المحلي phosphoinositol-4،5-biphosphate (PI (4،5) ف 2) في قاعدة الكأس أكلة، الأكتين التحلل يعتمد على تحويل (PI (4،5) ف 2 إلى كل من التعديلات phosphoinositol-3،4،5-biphosphate (PI (3،4،5) ف 3) 3 و 9.لا غنى عنها كما يؤدي السابقة للتمديد الناجح لpseudopods حول الهدف وهذا الأخير تمكن غرق الجزيئات في العصارة الخلوية للبلعمية 10.
الخلايا التي لديها القدرة في phagocytose إما البالعات المهنية، مثل الضامة / حيدات، والمحببة / العدلات، والخلايا الجذعية (DCS) أو البالعات غير مهني، مثل الخلايا الليفية والخلايا الظهارية 11. البلعمة التي يقوم بها كل البالعات تلعب دورا مركزيا في صيانة الأنسجة وإعادة عرض، في حين البلعمة التي يقوم بها البالعات المهنية هي المسؤولة عن تنسيق الاستجابة المناعية الفطرية والتكيفية ضد مسببات الأمراض. البالعات المهنية لا فقط يغمر وقتل الممرض، ولكن أيضا المستضدات الموجودة على الخلايا اللمفاوية في الجهاز المناعي التكيفي. هذا يساهم في الإفراج عن السيتوكينات الموالية للالتهابات وإلى إشراك الخلايا اللمفاوية، وبالتالي يؤدي إلىالحصار الناجح لإصابة 12.
وقد تقنيات الكيمياء الحيوية التقليدية دورا أساسيا في اكتساب المعرفة حول الآلية الجزيئية من العمليات الخلوية المختلفة خلال البلعمة، مثل التعديلات بعد متعدية ومختلف الجمعيات عالية تقارب بين البروتينات. ومع ذلك، فمن الصعب الحصول على معلومات بشأن ديناميات المكانية والزمانية لأحداث أكلة باستخدام الطرق الكيميائية الحيوية التقليدية. الخلية الحية التصوير ليس فقط يسمح لنا لرصد الأحداث الخلوية بطريقة حساسة الوقت ولكن أيضا تمكننا من الحصول على معلومات على مستوى خلية واحدة. نحن هنا تصف طريقة للتحقيق في مراحل مختلفة من البلعمة، وكذلك لتحليل العملية برمتها spatiotemporally باستخدام متحد البؤر المجهري.
Protocol
Representative Results
Discussion
البالعات المهنية، مثل الضامة والخلايا الجذعية، تبتلع، والقضاء على غزو الجراثيم مما يجعل البلعمة عنصرا هاما من نظام دفاع المضيف. وخلال هذه العملية البالعات تخضع إعادة تنظيم الغشاء واسعة النطاق وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي في سطحها خلية 8، …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ويندي السلمون ونيكي واتسون للمنشأة كيك في معهد وايتهيد من معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا للتصوير.
Materials
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Cell Signaling Technology | 9998 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | BP-231-1 | |
| DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium) | Gibco | 11965 | |
| PBS, 1X (Phosphate- Buffered Saline) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | |
| FITC-coupled IgG-coated latex beads | Cayman | 500290 | |
| L-Glutamine 200mM (100X) | ThermoFisher | 25030081 | |
| Paraformaldehyde Solution (4% in PBS) | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Penicillin-streptomycin (10'000U/mL) | ThermoFisher | 15-140-122 | |
| Phalloidin-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute) | Gibco | 61870 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | S7900 | |
| Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS) | Corning cellgro | MT25900CI | |
| Trypsin-EDTA (1X) (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | Z23374 | |
| Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers) | ThermoFisher | 155361 | |
| Glasstic slide 10 with grids | Hycor | 87144 |
References
- Janeway, C. A., Medzhitov, R. Innate immune recognition. Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).
- Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Botelho, R. J., et al. Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis. J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).
- Tafesse, F. G., et al. Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans. PLoS Pathog. 11, e1005188 (2015).
- Kwik, J., et al. Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin. PNAS. 100, 13964-13969 (2003).
- Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D. Phosphoinositides in phagocytosis and macropinocytosis. BBA. 1851, 805-823 (2015).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).
- Strijbis, K., et al. Bruton’s Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages. PLoS Pathog. 9, e1003446 (2013).
- Li, X., et al. The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance. Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).
- Esteban, A., et al. Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages. PNAS. 108, 14270-14275 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
- Jaumouille, V., et al. Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering. Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).
- Forestier, C. L. Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis. Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).
- John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii. Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).
