We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.
Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.
브릴 루앙 광 산란 (BLS) 효과는 그것은 재료의 열적으로 활성화 음향 포논에 의해 가시 광선의 비탄성 산란으로 구성되어 1922 년 1 레옹 브릴 리언에 의해 발견됐다. 고체 물리학에서, 음향 포논은 격자의 모든 원자의 일관된 진동이다. 격자 내의 원자 개의 교번 종류의 일차원 체인 IR 흡수 및 라만 산란 (도 1)에 의해 프로브 BLS 계시 음향 포논, 광학 포논의 차이를 나타내는 단순 모델이다. 광학 포논은 원자의 반대 위상 운동이다 동안 음향 포논는 (길이 음향 포논) 또는 전파 방향 (횡 음향 포논)에 수직 전파 방향을 따라 변위 사슬 원자의 위상 이동되어 진동 전기 쌍극자 모멘트를 생산하는 (세로 또는 가로 모드).
BLS의 분광SCOPY은 1920 년대 이후 분석 과학 분야에서 사용되어왔다; 하지만, 1980 년대 이후에만 높은 콘트라스트 측정은 탠덤 멀티 패브리 페롯 분광계를 사용하여 수 있었다. 그 이후로, 2-4 및 자성 재료 (광자-인 Magnon의 상호 작용을 통해) (광자 – 포논 상호 작용이 이용된다) 응집 물질의 분석 애플리케이션을위한 BLS의 발전의 증가 (5)가 초래되고있다. 생물 의학 응용 6-8에 정액 작품 여기서 적용된 하나의 탄성 텐서의 완전한 설명을 달성하기 위해 혈소판 형으로 반사 기판을 사용하여 이전에 9 기재된 것을 포함하여, 다양한 방법의 발전 경로를 마련했다 샘플.
본 연구에서, 우리는 섬유 단백질 엘라스틴 결합 조직의 세포 외 기질의 기본 구성 요소에 BLS 분광법을 적용하고 I-콜라겐을 입력합니다. 티I 콜라겐 YPE하는 등의 힘줄과 같은 조직에서 기본적으로 단단한 섬유를 형성하기 위해 광범위한 교차 연결 측 방향 및 세로 방향으로 조립 강성, 삼중 나선 분자이다. 콜라겐 네트워크는 종종 엘라스틴의 네트워크와, 비정상적 엔트로피와 환경과의 소수성 상호 작용의 조합을 통해 장거리 탄성을 생성 및 폐 및 피부와 같은 조직의 기능에 필수적인 단백질을 공존. 모두 섬유가 현재 연구 육방 모델을 이용하여 모델링된다. (9) 1 부에서는, 동물 조직으로부터 섬유를 추출하고, 분광 측정을위한 샘플을 제조하는 프로토콜을 기술한다. Part 2에서는 브릴 루앙 장치를 설정하고 섬유로부터 스펙트럼을 획득하기위한 절차가 제공된다. 3 부 내부에 포함 된 관련 기계적 정보를 추출하는 브릴 루앙 스펙트럼에 적용된 데이터 분석의 상세를 제공한다. 그런 다음, 대표적인 결과 제시 및 discusse된다디.
브릴 루앙 산란 분광법 단백질 섬유의 탄성 텐서의 각 구성 요소가 상세히 전례 특징으로 할 수있는 유일한 수단이다. 또한, 측정은 미세 규모에 이루어질 수함으로써 복잡성의 중요성 기계적, 아마도 기능을 이해하기 처음 우릴 수 생물학적 구조의 마이크로 스케일 역학에 신규 한 통찰력을 우리에게 제공 할 매트릭스 구조와 생화학에 최근 공개 된.
이 기술은 GHz 주파수 범위에서, 기계적 성질을 측정한다. 이 도메인 구조 생체 고분자에 대한 이전 탐험 적이 그것은 모두 상승 탄력의 분자 메커니즘에 대한 근본적인 질문에 대답 할 수있는 수단을 제공한다.
우리는 동물 조직에서 콜라겐과 엘라스틴 섬유를 추출 및 브릴 루앙 scatteri를 측정하는 단계를 설명광 역학의 완전한 설명을 달성하기 위해 반사성 기판을 사용 NG 스펙트럼. 프로토콜 내에서 중요한 단계는 정제 된 섬유가 얻어진다 적절한 실험 조건은 섬유 성 단백질의 재현성 측정 장소에 있는지 확인 것들이다. 그러나, 추출 절차는 섬유의 기계적 특성을 수정할 수 유념해야한다.
기술의 수정은 microfocused 브릴 루앙 산란 및 매핑을위한 광학 현미경과 함께 커플 링 (13)에 접근 포함 보완 기술로 가능한 조합 (예를 들어, 라만 산란). 기술의 현재 응용 프로그램은 주로 적출 생물학적 물질에 초점을 맞추고있다,하지만 중요한 발전은, 예를 들면, 여러 VIPA 탈론 (14)에 따라 사람들은 이미 응용 프로그램의 범위 악마와 함께 침대 옆에 벤치 탑에서이 기술의 번역을 가능하게하는생체 내 응용 프로그램에서 잠재력을 포함하여 15, 16 strated. VIPA 접근 방식은 우리가 무엇을 설명에 대한 대안이다 이것은 빠른 획득 시간을 가지고 있지만, 이러한 여기 분석 것과 반드시 불투명 한 시료의 경우에는 적절하지 않다. 그 콘트라스트 준 탄성 광을 거부하기에 충분하지 않기 때문에 또한, 반사성 기재의 사용은 VIPA에 탈론을 사용하여 셋업에서 실용적이지 않다. 스펙트럼 데이터 집합 및 재료의 본래 약한 산란 단면적의 인수 속도와 관련된 제한 동적 생물학적 시스템과 깊은 조직 내에서 데이터의 취득 프로그램을 제한 할 수 있지만, 기술적 인 개선은 현재의 성능이 개선 될 수있다.
BLS는 세포 외 기질에 기초 생물 물리학 연구에 중요한 도구가 될 것을 약속함으로써 새로운 매트릭스 성장하는 동안 기계적 특성의 진화에 대한 통찰력과 병리학에서의 손실을 생산하는퇴화. 그러나, 측정은 비 침습적이며, 따라서 생체 내에서 수행 될 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요하다. 실제로, 이것은 이미 각막 (16)에 달성 된 그러한 작업은 결합 조직 장애의 다양한 새로운 진단 도구의 개발을위한 플랫폼을 제공 할 수있다.
초음파 탄성 영상 및 원자 힘 현미경 (AFM)는 마이크로 기계식 측정 대체 방법 있지만 BLS 기술은 AFM 달리, 전자 및 이상 (a 세포 내 규모)보다 공간 해상도를 제공 시험편에 기계적인 힘을 부과하지 않고 한정되지 않는다 오직 표면 특징의 분석. 거시적 인 균주에서 영의 계수는 MPa의 순서 (자세한 내용은 다른 곳에서보고됩니다)의 수 있습니다 동안 콜라겐과 엘라스틴의 브릴 루앙 계수는 GPa의 범위에 있습니다. 이 결과에 의해, 여기 주파수에 강한 의존성 차동 탄성률을 나타낸다섬유의 점탄성 거동. BLS는 의치 과학 문제 광범위한 물질에 적용 할 수있다. 그것은 생리학 및 생물 학적 조직의 병리에 대한 질문에 대답하는 데 도움이뿐만 아니라 분자 수준에서 물질과의 상호 작용의 기본적인 이해를위한 물리적 도구를 제공 할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council [grant number EP/M028739/1]. RSE was supported by a Santander Postgraduate Research Award 2015.
Chondroitinase ABC | Sigma-Aldrich | C2905 | |
Tris Buffer | Fluka | 93358 | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | S608-500 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Sodium Azide | Fisher Scientific | S2002 | |
Streptomyces Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H1136-1AMP | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S7653 | |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T4665 | |
Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S320-500 | |
Pure Water | Millipore | ZRQS0P3WW | Produced In-House |
Distilled Water | Bibby Scientific Limited | D4000 | Produced In-House from water still |
Euthatal | Merial | J01601A | |
Tandem Interferometer TFP-1 | JRS Scientific Instruments | ||
Freezer | Lec | TU55144 | |
Refrigerator | Zanussi | ZBA15021SA | |
Hot Plate | Fisher Scientific | SP88857206 | |
Clamps | VWR | 241-7311 & 241-7201 | |
Clamp Stand | VWR | 241-0093 | |
Thermometer | Fisher Scientific | 13-201-401 | |
Cling Film | Sainsbury's | 7650540 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
Silicone | IDB Technologies | N/A | No catalogue number. Order upon request |
Cover Glass | VWR | 631-1571 | |
Conical Flask | VWR | 214-1175 | |
Beaker | VWR | 213-0469 | |
Measuring Cylinder | VWR | 612-3838 | |
Vial | VWR | 548-0051 & 548-0863 | |
Petri Dish | VWR | 391-0441 | |
Scalpel | Swann Morton Ltd | 0914 & 0308 | |
Diamond Scribe | RS Instruments | 394-217 | |
Soldering Iron | RS Instruments | 231-5332 | |
Fine Forceps | VWR | 232-0188 | |
Double Micro-Spatula | VWR | Various Sizes | |
pH Meter | Hanna Instruments | HI-2210-02 | |
Orbital Shaker | IKA | 0002819000 |