Pluripotenti indotte generazione di cellule staminali da cellule del sangue Utilizzando Sendai Virus e centrifugazione
Summary
We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.
Abstract
Il recente sviluppo di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) ha dimostrato che le cellule somatiche mature possono tornare a una, stato pluripotente indifferenziata. Ora, riprogrammazione avviene con vari tipi di cellule somatiche adulte: cheratinociti, cellule urina, fibroblasti, ecc I primi esperimenti erano solitamente fatto con fibroblasti dermici. Tuttavia, questo richiede una procedura chirurgica invasiva per ottenere fibroblasti da pazienti. Pertanto, cellule in sospensione, come le cellule del sangue e delle urine, sono stati considerati ideali per la riprogrammazione causa della convenienza di ottenere le cellule primarie. Qui, riportiamo un protocollo efficace per la generazione di IPSC dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Con placcatura le PBMC trasdotte in serie ad un nuovo, piastra con centrifugazione a matrice rivestita, questo protocollo può fornire facilmente colonie IPSC. Questo metodo è applicabile anche per le cellule mononucleate del sangue del cordone ombelicale (CBMCs). Questo studio presenta un prot semplice ed efficienteOcol per la riprogrammazione di PBMC e CBMCs.
Introduction
Le cellule staminali sono stati uno dei materiali più interessanti nella terapia clinica per gli ultimi decenni 1. Le proprietà interessanti di cellule staminali sono pluripotenza e la capacità di auto-rinnovarsi. Nel 1981, le prime cellule staminali embrionali (ESC) sono stati isolati dal embrione di topo 2. Tuttavia, quando la tecnica è stata applicata agli embrioni umani, ha affrontato diverse questioni etiche.
Nel 2006, quando il dottor Yamanaka e il suo team riprogrammate la prima cella pluripotenti da cellule somatiche del mouse, il campo delle cellule staminali ha riguadagnato la sua possibilità e l'interesse si è riaccesa 3. Offrendo diversi fattori definite, cellule staminali pluripotenti sono state con successo "indotte" dalle cellule somatiche adulte, e furono così chiamati "cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)." Nel 2007, questa tecnica è stata applicata a cellule umane 4, cedendo le cellule con le caratteristiche esatte della CES, ma nessuno del dibattito etico. Teoricamente, iPSCs può essere generato da qualsiasi tipo cellulare ottenuta da qualsiasi individuo o paziente. iPSCs paziente-specifici sono in aumento come un potenziale strumento in grado di simulare i fenotipi di malattia e le condizioni epigenetici di ogni singolo paziente. Usando la modifica del gene o altri metodi che possono invertire la condizione patogena, iPSCs paziente-specifici possono essere utilizzati anche in medicina personalizzata 5. Inoltre, iPSCs sono meno associati con rigetto immunitario perché hanno la stessa identità immunitario come il donatore, rendendo l'auto-trapianto più fattibile 6. Pertanto, iPSCs sono diventate la piattaforma più promettente nella modellazione della malattia, lo screening di stupefacenti, e le terapie rigenerative. Alla luce di questi vantaggi, protocolli migliorati che possono dare più puro e rendimenti più elevati nel minor tempo possibile dalla sorgente più piccola cellula sono costantemente in fase di sviluppo. Una considerazione importante di trovare il protocollo più efficiente per applicazioni future è il tipo di cellula primaria. La maggior parte della prima generazione proto iPSCCols sono ottimizzati per cellule aderenti dal momento che le linee originali IPSC sono state indotte da fibroblasti cutanei 4. Tuttavia, l'isolamento e la preparazione di queste cellule sono lavoro intensivo. Inoltre, l'isolamento di fibroblasti cutanei comprende procedure chirurgiche invasive che possono diventare una grave lacuna per la più ampia applicazione.
Pertanto, per l'ulteriore uso di iPSCs, è necessaria una fonte cella con acquisizione conveniente. Il sangue è considerato come fonte di cellule ideale in quanto ottenuto attraverso una procedura piuttosto minimamente invasiva 7-9. In questo studio, abbiamo sviluppato una semplice modifica al protocollo generare hiPSCs da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Senza il difficile processo di espansione di un tipo di cellula specifica, come le cellule CD34 +, le cellule del sangue intero o PBMC sono stati in serie placcato su piastre rivestite di matrice per centrifugazione dopo trasduzione con il virus di Sendai contenente fattori Yamanaka. Questo metodo riduce il tempo richiesto per lal'attaccamento delle cellule galleggianti trasdotte e diminuito la perdita di cellule riprogrammate che non erano in grado di collegare in proprio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dal momento che le cellule staminali embrionali (CSE) hanno evidenziato diverse lacune, è stato richiesto l'esigenza di uno strumento alternativo. Pertanto, lo sviluppo delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) da Yamanaka è venuto sotto i riflettori internazionali. E 'stato quasi un decennio da quando Yamanaka ha scoperto che pluripotenza può essere indotta con l'aggiunta di soli quattro geni nelle cellule somatiche adulte. Dal momento che iPSCs sono "indotte" dalle cellule somatiche…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science, ICT, and Future Planning (2013R1A1A1076125).
Materials
| Plasticware | |||
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| 24-well Plate | TPP | 92024 | |
| PBMC Isolation Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Blood cell media |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Blood cell media supplement (100x) |
| iPSC Generation and Culture Materials | |||
| CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A16518 | |
| TeSR-E8 Media | STEMCELL Technologies | 5940 | iPSC media |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Colony detaching solution |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Rinse Buffer |
| Sodium Chloride | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Rinse Buffer |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Rinse Buffer |
| Hydrochloric Acid | Duksan | 1129 | Rinse Buffer |
References
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