Advanced Animal Model af kolorektal Metastase i Lever: Imaging teknikker og Ejendomsstyrelsen mod metastatiske kloner

Summary

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

Abstract

Patienter med et begrænset antal levermetastaser og langsomme satser for progression held kan behandles med lokal behandling nærmer ^1,2. Men lidt om heterogenitet levermetastaser, og der er behov dyremodeller stand til at vurdere udviklingen af ​​individuelle metastatiske kolonier. Her præsenterer vi en avanceret model af levermetastaser, der giver evnen til kvantitativt at visualisere udviklingen af ​​individuelle tumor kloner i leveren og vurdere deres vækst kinetik og kolonisering effektivitet. Vi genererede et panel af monoklonale derivater af HCT116 humane kolorektal cancer celler stabilt mærket med luciferase og tdTomato og besidder andre vækst- egenskaber. Med en milt injektion efterfulgt af en splenektomi, de fleste af disse kloner er i stand til at generere levermetastaser, men med forskellige frekvenser af kolonisering og varierende vækstrater. Brug af in vivo-afbildning system (IVIS), er det muligt at visualisere og kvantificere metastase udvikling med in vivo luminescerende og ex vivo fluorescerende billeddannelse. Desuden Diffus Luminescent Imaging Tomography (DLIT) tilvejebringer et 3D fordeling af levermetastaser in vivo. Ex vivo fluorescerende billeddannelse af høstede lever tilvejebringer kvantitative målinger af individuelle hepatiske metastatiske kolonier, der giver mulighed for evaluering af frekvensen af leveren kolonisering og vækstkinetikken af metastaser. Eftersom modellen ligner klinisk observerede levermetastaser, kan det tjene som en modalitet til detektering gener associeret med levermetastaser og til afprøvning potentielle ablative eller adjuvans behandlinger for leveren metastatisk sygdom.

Introduction

Patienter med levermetastaser fra primære tarmkræft (CRC) er karakteriseret ved en dårlig prognose. Den 5-årige overlevelsesrate for primære nonnmetastatisk CRC (trin I – III) er estimeret som 75 – 88% ^3,4, mens patienter med levermetastaser (fase IV) har en 5-års overlevelse på Kun 8 – 12% ^{5 6.} Men metastatiske patienter udgør en heterogen gruppe, præsentere med forskellige antal metastaser og forskellige gentagelse tidspunkter. Kliniske observationer indikerer, at antallet af metastaser (som kan være proportional med koloniseringsevne eller hyppigheden af kolonisering) og størrelsen af en enkelt metastase (proportional med den lokale vækstrate) er uafhængige prognostiske faktorer ^1,7. Med andre ord, succes metastatiske kloner koloniserer leveren afhænger af to vigtige egenskaber: deres evne til at vokse og deres evne til at formidle og overleve i leveren mikromiljø.

Designetaf succesfulde kliniske modeller med evnen til at opfange og kvantificere egenskaber metastatiske kloner kan drastisk forbedre vores forståelse af levermetastaser biologi og giver et effektivt redskab til design af potentielle terapeutiske tilgange. Modeller af eksperimentel levermetastaser er tidligere blevet rapporteret ^8,9, men ingen af dem billede evnen til kvantitativt at indfange og beskrive egenskaberne af de enkelte metastatiske kloner både in vivo og ex vivo.

Her præsenterer vi en ny, avanceret model af levermetastaser, der omfatter generering af tumor-kloner med forskellige lever kolonisering effektivitet og vækst egenskaber. Vi anvendte en kombination af dobbelt-mærkning af cancerceller med luciferase og tdTomato fluorescerende protein med frembringelsen af ​​monoklonale cellelinier, der har iboende forskelle i metastatisk kapacitet. I denne forsøgsmodel, de data indikerer, at udviklingen aflevermetastaser kan beskrives med hensyn til kolonisering frekvens og fordoblingstid (Td), som er konsistent med kliniske observationer. Den kvantitative karakter af denne model gør det let bortadopteres for lægemiddelforskning og diagnostiske formål.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Chicago (protokol # 72.213-09) og udføres under sterile forhold. 1. Forberedelser Gør 500 ml medium til dyrkning af HCT116 tumorceller: Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS), 100 U / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin. Autoklaveres de instrumenter, der skal bruges til milten injektion model, herunder 3 – 4 kirurgiske håndklæder, gaze, to små A…

Representative Results

Målet med dette forsøg var at etablere en sammenhængende og let reproducerbar dyremodel med potentiale for den serielle kvantificering af in vivo metastatisk tumor byrde og for estimering af koloniserende frekvens og vækst kinetik udvikle levermetastaser. Figurerne 2-6, med legender, leveres fra vores tidligere publikation under en Creative Commons CC-BY-licens 10. Generation af Double-mæ…

Discussion

Dyret model præsenteres i den aktuelle rapport er baseret på to store tilgange. Først, for at sikre evnen til at iagttage metastatiske kloner med forskellige tilbøjeligheder til at kolonisere og proliferere i leveren, blev et panel af stærkt heterogen monoklonale cellelinjer etableret, frem for en etableret ufraktioneret cancercellelinie ^12,13. Det monoklonale tilgang til metastase udvikling er begrundet i de seneste genomiske data ¹⁴ og blev med succes anvendt tidligere til at modellere den m…

Materials

IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Caliper Life Sciences	124262	In vivo imaging system
LivingImage 4.0 Software	Caliper Life Sciences	128165	Imaging software
VAD-MGX Research Anesthetic Machine	Vetamac	VAD-MGX	Inhalation anesthesia machine
DMEM	Gibco	11965-118	Cell culture reagents
DPBS	Gibco	14190250	Cell culture reagents
Penicillin-Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin)	Invitrogen	15140163	Cell culture reagents
HBSS	ThermoFisher	24020117	Cell culture reagents
Buprenex Injection (0.3mg/mL)	Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.	12496-0757-5	Buprenorphine hydrochloride
Gemini Cautery System	Braintree Scientific	GEM 5917	Hand-held cautery for splenectomy
Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5mm Clip Width; 10mm Jaw Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5426	Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection
D-luciferin, potassium salt	Goldbio Technology	LUCK-1G	Luciferin potassium salt
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985062	Reduced Serum Medium
TC20 Automated Cell Counter	BIO-RAD	1450102	Automatic cell counter
JMP10 software	SAS Institute		Data analysis software
BD FACSAria II cell sorter	BD Biocsiences		Cell sorter