מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי
Summary
The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.
Abstract
חולים עם מספר מצומצם של גרורות בכבד ושיעורים איטיים של התקדמות יכולים להיות מטופלים בהצלחה עם טיפול מקומי גישות 1,2. עם זאת, מעט מאוד ידוע על ההטרוגניות של גרורות בכבד, ומודלים של בעלי החיים מסוגלים להעריך את ההתפתחות של מושבות גרורתי בודדות נדרשים. כאן, אנו מציגים מודל מתקדם של גרורות בכבד המספקות את היכולת לדמיין את ההתפתחות כמותית של שיבוטי גידול פרט בכבד להעריך קינטיקה הצמיחה ויעילות קולוניזציה שלהם. יצרנו פאנל של נגזרים monoclonal של תאי סרטן המעי הגס האנושי HCT116 שכותרתו ביציבות עם בלוציפראז ו tdTomato והחזקת נכסים צמיחה שונים. עם הזרקת טחול ואחריו כריתת טחול, רוב השיבוטים אלה מסוגלים ליצור גרורות בכבד, אבל עם תדרים שונים של קולוניזציה ושיעורי צמיחה שונה. באמצעות syste הדמיה in vivoמ '(IVIS), אפשר לחזות ולכמת פיתוח גרור עם זורח in vivo ו דימות פלואורסצנטי vivo לשעבר. בנוסף, טומוגרפיה ההדמיה המפוזרת פלורסנט (DLIT) מספקת הפצת 3D של גרורות בכבד in vivo. דימות פלואורסצנטי Ex vivo של כבדים שנקטפו מספקת מדידות כמותיות של מושבות גרורתי בכבד בודדת, המאפשרת להערכת תדירות קולוניזציה כבדה קינטיקה הצמיחה גרורות. מאז המודל דומה גרורות בכבד שנצפו קלינית, היא יכולה לשמש אופנות לאיתור גנים הקשורים גרורות בכבד לבדיקת טיפולים פולשני או אדג'ובנטי פוטנציאל מחלה גרורתית בכבד.
Introduction
חולים עם גרורות בכבד מסרטן מעי גס ראשוני (CRC) מאופיינים פרוגנוזה גרועה. שיעור ההישרדות לאחר 5 שנים עבור העיקרי nonmetastatic CRC (בשלבים I – III) מוערך 75 – 88% 3,4, בעוד חולים עם גרורות בכבד (בשלב IV) יש שיעור ההישרדות לאחר 5 שנים של רק 8 – 12% 5 , 6. עם זאת, חולים עם גרורות מייצגים קבוצה הטרוגנית, עם הצגת מספרים שונים של גרורות ושעות ישנות שונות. תצפיות קליניים הראו כי מספר גרורות (אשר עשוי להיות פרופורציונלי ליכולת או תדירות מיישבים של קולוניזציה) ואת הגודל של כל גרורה בודדת (ביחס ישר לשיעור הגידול המקומי) 1,7 גורמים פרוגנוסטיים בלתי תלויים. במילים אחרות, ההצלחה של שיבוטים גרורתי מיישבים את הכבד תלויה בשני מאפיינים עיקריים: היכולת שלהם לגדול יכולתם להפיץ ולשרוד במיקרו-סביבה של הכבד.
העיצובמודלים קליניים מוצלחים של עם היכולת של לכידה וכימותי המאפיינים של שיבוטים גרורתי יכול לשפר את הבנתנו דרסטי של ביולוגיה כבדה גרורה ולספק כולים יעילים על העיצוב של גישות טיפוליות פוטנציאליות. מודלים של גרורות בכבד ניסיוני דווחו בעבר 8,9, אבל אף אחד מהם לא סיפק את היכולת ללכוד כמותית לתאר תכונות של שיבוטים גרורתי הפרט הן in vivo ו vivo לשעבר.
כאן, אנו מציגים מודל חדש, מתקדם של גרורות בכבד הכוללת את הדור של שיבוטי גידול עם יעילות קולוניזציה הכבדה שונה ומאפיין צמיחה. העסקנו שילוב של תיוג כפול של תאים סרטניים עם בלוציפראז ו פלורסנט חלבון tdTomato עם הדור של שורות תאים חד שבטיים שיש הבדלים מהותיים בתוקף גרורתי. במודל ניסיוני זה, הנתונים מצביעים כי ההתפתחותגרורות בכבד יכול להיות מתואר במונחים של תדירות קולוניזציה זמן ההכפלה (TD), אשר עולה בקנה אחד עם תצפיות קליניות. אופי כמותי של מודל זה עושה את זה לאימוץ בקלות עבור גילוי סמים למטרות אבחון.
Protocol
Representative Results
Discussion
המודל החי שהוצג בדוח הנוכחי מבוסס על שתי גישות עיקריות. ראשית, על מנת להבטיח את היכולת להתבונן שיבוטים גרורתי עם נטיות שונות ליישב מתרבים בכבד, פאנל של שורות תאים חד שבטיים הטרוגנית מאוד הוקמה, ולא קו תאים סרטניים unfractionated הוקמה 12,13. הגישה monoclonal להתפתחות גרורות מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד"ר ג'פרי ל גרין (אוניברסיטת שיקגו) עבור פלסמיד Luc2-tdTomato ואת שורת תאים HCT116, מר Ani Solanki (מרכז משאבים בעלי חיים) לניהול עכברים, וד"ר לארה לאוני על הסיוע עם DLIT. Quantifications בעוצמות פלורסנט ושקוף למחצה בוצעו משאבים מחקר הדמיה בעלי חיים קטנים משולב באוניברסיטת שיקגו על ספקטרום IVIS (PerkinElmer, Hopkinton, MA). עבודה זו נתמכה על ידי וירג'יניה ו DK לודוויג קרן לחקר הסרטן, קרן המחקר לסרטן ריאות (LCRF), קרן סרטן הערמונית (PCF), ואת גרנט תמיכה במרכז לחקר הסרטן (P30CA014599). המממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
Materials
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Caliper Life Sciences | 124262 | In vivo imaging system |
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | 128165 | Imaging software |
| VAD-MGX Research Anesthetic Machine | Vetamac | VAD-MGX | Inhalation anesthesia machine |
| DMEM | Gibco | 11965-118 | Cell culture reagents |
| DPBS | Gibco | 14190250 | Cell culture reagents |
| Penicillin-Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) | Invitrogen | 15140163 | Cell culture reagents |
| HBSS | ThermoFisher | 24020117 | Cell culture reagents |
| Buprenex Injection (0.3mg/mL) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | Buprenorphine hydrochloride |
| Gemini Cautery System | Braintree Scientific | GEM 5917 | Hand-held cautery for splenectomy |
| Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5mm Clip Width; 10mm Jaw Length | Roboz Surgical Instrument | RS-5426 | Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio Technology | LUCK-1G | Luciferin potassium salt |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Reduced Serum Medium |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450102 | Automatic cell counter |
| JMP10 software | SAS Institute | Data analysis software | |
| BD FACSAria II cell sorter | BD Biocsiences | Cell sorter |
References
- Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).
- Pawlik, T. M., et al. Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases. Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).
- Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host. Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).
- Veen, T., et al. Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk. J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).
- Siegel, R., et al. Cancer treatment and survivorship statistics. CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).
- O’Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J. Natl. Cancer Inst. 96 (19), 1420-1425 (2004).
- House, M. G., et al. Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution. J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).
- Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse. J. Surg. Res. 122 (2), 225-230 (2004).
- Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Oshima, G., et al. Imaging of tumor clones with differential liver colonization. Sci. Rep. 5 (10946), (2015).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Wang, X. M., et al. Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer. PLoS One. 8 (2), e55714 (2013).
- Fidler, I. J., Kripke, M. L. Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor. Science. 197 (4306), 893-895 (1977).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Khodarev, N. N., et al. STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy. PLoS One. 4 (6), e5821 (2009).
- Langley, R. R., Fidler, I. J. Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis. Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).
- Lussier, Y. A., et al. Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs. PLoS One. 7 (12), e50141 (2012).
- Lussier, Y. A., et al. MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es). PLoS One. 6 (12), e28650 (2011).
- Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
- Vanharanta, S., Massague, J. Origins of metastatic traits. Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).
- Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth. Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).
- Li, C., et al. Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J. Vis. Exp. (10), (2007).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J. Vis. Exp. (27), e51677 (2014).
- Evans, J. P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).
