Advanced djurmodell av Colorectal metastas i Lever: avbildningsmetoder och egenskaper av metastaserande kloner
Summary
The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.
Abstract
Patienter med ett begränsat antal levermetastaser och låga hastigheter av progression kan behandlas framgångsrikt med lokal behandling närmar sig 1,2. Men lite är känt om heterogenitet levermetastaser, och djurmodeller kan utvärdera utvecklingen av enskilda metastatiska kolonier behövs. Här presenterar vi en avancerad modell av levermetastaser som ger möjlighet att kvantitativt visualisera utvecklingen av enskilda tumör kloner i levern och uppskatta deras tillväxt kinetik och kolonisering effektivitet. Vi genererade en panel av monoklonala derivat av HCT116 humana kolorektala cancerceller stabilt märkta med luciferas och tdTomato och som har olika tillväxtegenskaper. Med en mjälten injektion följt av en splenektomi, de flesta av dessa kloner kan generera levermetastaser, men med olika frekvenser av kolonisering och varierande tillväxttakter. Med användning av in vivo imaging System (IVIS), är det möjligt att visualisera och kvantifiera metastaser utveckling med in vivo självlysande och ex vivo fluorescerande avbildning. Dessutom Diffus Luminescent Imaging Tomography (DLIT) tillhandahåller en 3D-fördelning av levermetastaser in vivo. Ex vivo fluorescerande avbildning av skördade levrar ger kvantitativa mätningar av individuella levermetastatiska kolonier, vilket möjliggör utvärdering av frekvensen av lever kolonisering och tillväxt kinetik av metastaser. Eftersom modellen liknar kliniskt observerade levermetastaser, kan det fungera som en modalitet för att detektera gener associerade med levermetastaser och för att testa potentiella ablativ eller adjuvant behandling för lever metastaserad sjukdom.
Introduction
Patienter med levermetastaser från primära kolorektala cancer (CRC) kännetecknas av en dålig prognos. 5-års överlevnad för primära icke-metastaserad CRC (stadier I – III) uppskattas till 75-88% 3,4, medan patienter med levermetastaser (stadium IV) har en 5-års överlevnad på endast 8-12% 5 , 6. Men patienter med metastaserande representerar en heterogen grupp, uppvisar olika antal metastaser och olika återkommande gånger. Kliniska observationer tyder på att antalet metastaser (som kan vara proportionell mot koloniseringsförmåga eller frekvensen av kolonisering) och storleken på varje enskild metastas (proportionell mot den lokala tillväxten) är oberoende prognostiska faktorer 1,7. Med andra ord, framgång metastaserande kloner kolonisera levern beror på två viktiga egenskaper: deras förmåga att växa och deras förmåga att sprida och överleva i levern mikromiljö.
Designenframgångsrika kliniska modeller med förmåga att fånga och kvantifiera egenskaperna hos metastaserande kloner kan drastiskt förbättra vår förståelse av levermetastaser biologi och ge ett effektivt verktyg för utformningen av potentiella terapeutiska metoder. Modeller av experimentell levermetastaser har tidigare rapporterats 8,9, men ingen av dem gav förmågan att kvantitativt fånga och beskriva egenskaper hos enskilda metastaserande kloner både in vivo och ex vivo.
Här presenterar vi en ny, avancerad modell av levermetastaser som inkluderar generering av tumör kloner med olika lever kolonisering effektivitet och tillväxtegenskaper. Vi använde en kombination av dubbel-märkning av cancerceller med luciferas och tdTomato fluorescerande protein med genereringen av monoklonala cellinjer som har inneboende skillnader i metastatisk kapacitet. I denna experimentella modell, visar data att utvecklingen avlevermetastaser kan beskrivas i termer av kolonisering frekvens och dubbleringstid (Td), vilket överensstämmer med kliniska observationer. Den kvantitativa naturen hos denna modell gör det lätt att adoptable för läkemedelsutveckling och diagnostiska ändamål.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modellen djur som presenteras i denna rapport bygger på två huvudinriktningar. Först, för att säkerställa förmågan att observera metastatiska kloner med olika benägenheter att kolonisera och proliferera i levern, var en panel av mycket heterogena monoklonala cellinjer etableras, i stället för en etablerad ofraktionerat cancercellinjen 12,13. Den monoklonala syn på metastaser utveckling motiveras av de senaste genetiska data 14 och framgångsrikt använts tidigare för att modellera meta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr Geoffrey L. Greene (University of Chicago) för Luc2-tdTomato plasmid och HCT116 cellinje Mr Ani Solanki (Animal Resource Center) för mössen ledning, och Dr Lara Leoni för stöd med DLIT. Kvantifieringar av fluorescerande och luminescerande intensiteter utfördes i den integrerade smådjurs Imaging Research Resource vid University of Chicago på ett IVIS Spectrum (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Detta arbete stöddes av Virginia och DK Ludwig fonden för cancerforskning, Lung Cancer Research Foundation (LCRF), Prostate Cancer Foundation (PCF), och Cancer Center Support Grant (P30CA014599). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.
Materials
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Caliper Life Sciences | 124262 | In vivo imaging system |
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | 128165 | Imaging software |
| VAD-MGX Research Anesthetic Machine | Vetamac | VAD-MGX | Inhalation anesthesia machine |
| DMEM | Gibco | 11965-118 | Cell culture reagents |
| DPBS | Gibco | 14190250 | Cell culture reagents |
| Penicillin-Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) | Invitrogen | 15140163 | Cell culture reagents |
| HBSS | ThermoFisher | 24020117 | Cell culture reagents |
| Buprenex Injection (0.3mg/mL) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | Buprenorphine hydrochloride |
| Gemini Cautery System | Braintree Scientific | GEM 5917 | Hand-held cautery for splenectomy |
| Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5mm Clip Width; 10mm Jaw Length | Roboz Surgical Instrument | RS-5426 | Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio Technology | LUCK-1G | Luciferin potassium salt |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Reduced Serum Medium |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450102 | Automatic cell counter |
| JMP10 software | SAS Institute | Data analysis software | |
| BD FACSAria II cell sorter | BD Biocsiences | Cell sorter |
References
- Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).
- Pawlik, T. M., et al. Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases. Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).
- Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host. Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).
- Veen, T., et al. Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk. J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).
- Siegel, R., et al. Cancer treatment and survivorship statistics. CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).
- O’Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J. Natl. Cancer Inst. 96 (19), 1420-1425 (2004).
- House, M. G., et al. Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution. J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).
- Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse. J. Surg. Res. 122 (2), 225-230 (2004).
- Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Oshima, G., et al. Imaging of tumor clones with differential liver colonization. Sci. Rep. 5 (10946), (2015).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Wang, X. M., et al. Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer. PLoS One. 8 (2), e55714 (2013).
- Fidler, I. J., Kripke, M. L. Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor. Science. 197 (4306), 893-895 (1977).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Khodarev, N. N., et al. STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy. PLoS One. 4 (6), e5821 (2009).
- Langley, R. R., Fidler, I. J. Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis. Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).
- Lussier, Y. A., et al. Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs. PLoS One. 7 (12), e50141 (2012).
- Lussier, Y. A., et al. MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es). PLoS One. 6 (12), e28650 (2011).
- Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
- Vanharanta, S., Massague, J. Origins of metastatic traits. Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).
- Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth. Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).
- Li, C., et al. Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J. Vis. Exp. (10), (2007).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J. Vis. Exp. (27), e51677 (2014).
- Evans, J. P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).
