Karaktärisera elektrontransport genom levande biofilmer
Summary
Ett protokoll för mätning av elektriska conductivityen av levande mikrobiell biofilmer fysiologiskt relevanta villkor presenteras.
Abstract
Här visar vi metoden för elektrokemisk gating används för att karakterisera elektriska conductivityen av elektrod-odlade mikrobiell biofilmer fysiologiskt relevanta villkor. 1 dessa mätningar utförs på levande biofilmer i vattenhaltigt medium med källa och dränera elektroder mönstrade på en glasyta i en specialiserad konfiguration avses som matrisformel interdigitating elektrod (IDA). En biofilm odlas som sträcker sig över gapet ansluta source och drain. Potentialer tillämpas på elektroderna (ES och ED) genererar en källa-drain ström (ISD) genom biofilmen mellan elektroderna. Beroendet av elektrisk ledningsförmåga på gate potential (genomsnittet av de source och drain potentialerna, EG = [ED + ES] / 2) bestäms av systematiskt ändra porten potentiella och mäta det resulterande källa-avloppet aktuella. Beroendet av ledningsförmåga på gate potentiella ger mekanistiska information om extracellulära elektrontransport processen bakom den elektriska conductivityen av den specifika biofilmen under utredning. Den elektrokemiska Usenets mätmetoden som beskrivs här baseras direkt på som används av kollegor och R. W. Murray4,5,6 , M. S. Wrighton2,3 och kollegor i 1980 är för att undersöka tunn film ledande polymerer.
Introduction
Extracellulära elektrontransport (EET) är en process som gör att vissa mikroorganismer att transportera elektroner mellan intracellulära metabola processer och olösliga Elektronacceptorer eller givare som finns utanför cellen, alltifrån naturliga mineraler till elektroderna. I vissa fall kan EET mikroorganismer att bilda elektriskt ledande mång–cell tjocka biofilmer på elektroden ytor, där cellerna inte i direkt kontakt med elektroden fortfarande kan använda den som en metabolisk Elektronacceptor eller givare. Det finns ett stort intresse i sådana biofilmer som elektrod katalysatorer för olika applikationer, såsom mikrobiella electrosynthesis, förorening avkänning och borttagning, och remote energiproduktion och lagring,7,8,9 ,10,11,12,13,14 på grund av mångfalden av metaboliska processer utförs av mikroorganismer och hållbarhet av mikrobiell biofilm jämfört att enzym-baserade bioelectrodes. 15 , 16 dessutom EET vägar kan potentiellt användas till elektriskt kontroll eller signal förändringar i naturligt förekommande eller manipulerade genetiskt mikrobiell metaboliska processer inblandade, exempelvis i produktionen av en önskad produkt eller upptäckt av en target analyten eller stimulans. Den elektriska conductivityen av elektrokatalytiska biofilmer, vilket skiljer dem från andra biologiska material, är en central aspekt av deras elektrokatalytiska egenskaper, men lite är förstås om underliggande EET processen i elektrod-miljön och det som är känt är mycket omtvistade. 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24
Beskrivs här är en 2-elektrod metod att mäta konduktiviteten genom levande, elektrod-odlade biofilmer använda interdigitating elektrod arrayer (IDAs). IDAs består av parallella rektangulära elektroder mönstrad på planglas yta så att varje andra band är ansluten på motsatta sidor av den matris som resulterar i 2 elektroder (källa och avlopp). Noggrann undersökning av en IDA avslöjar (se exempelvis figur 6.12b i ref #1) att luckorna separera intilliggande band är också ansluten på ett sådant sätt att bilda en enda lucka som väver fram och tillbaka över den matris som skiljer de två elektroderna. Resultatet är en lång och smal lucka separera source och drain elektroderna, vilket ger mycket hög källa-avlopp strömmar när ett elektriskt ledande material är bildade, gjutna, polymeriseras eller över matrisen växt (när det gäller typ av biofilmer som behandlas här). Dessutom, resulterar den lilla storleken på elektroderna i små bakgrund aktuella på grund av kapacitans laddning och ändra i Oxidationstillstånd av det ledande materialet med förändring i gate potential, eftersom mängden material som behövs för att göra ledningsförmåga mätningar med IDAs är så liten. Tekniken med IDA-baserade elektrokemiska gating beskrivs här, utvecklat för att karakterisera tunn film ledande polymerer,2,3,4,25 har först nyligen tillämpats på levande system. 18 en annan teknik som används för att mäta konduktiviteten i levande biofilmer utnyttjade ett stort format split source och drain elektroder och källa meter att ställa in porten potentiella. 26 , 27 dock oro över dessa metoder har varit detaljerad tidigare. 18
Protokollet nedan sammanfattar vår erfarenhet med att göra ledningsförmåga mätningar av levande Geobacter sulfurreducens och biocathode MCL biofilmer. G. sulfurreducens är en modell elektrod minska organismen kan använda olösligt material, inklusive elektroder, som den enda metaboliska Elektronacceptor. Dessutom bildar tjocka biofilmer som klarar att transportera elektroner över flera cell längder, vilket gör det en ideal modellerar organism att studera anodisk långdistans extracellulära elektronöverföring. Vi har även Detaljer för studien av biocathode MCL, en aerob, autotrofa blandade gemenskapen biofilm isolerade från katoden av en bentiska mikrobiella bränsleceller. Biocathode MCL (uppkallad efter de tre primära beståndsdelarna – Marinobacter, Chromatiaceaea och Labrenzia) klarar av oxiderande en elektrod som dess enda elektron donator och transportera elektroner över flera cell längder, vilket gör det ett intressant katodiskt system att studera. Dessutom har biocathode MCL den högsta rapporterade ledningsförmågan för ett levande system hittills med dessa metoder. Införandet av dessa olika elektroaktiva biofilmer i detta protokoll är tänkt att markera att denna teknik är tillämpligt att mäta transport av elektroner genom någon levande biofilm kan elektriskt interagera med elektroder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under installationen av IDA är det viktigt att testa att källan och avloppet inte är kortsluten tillsammans före elektrokemiska Usenets mätningar, eftersom detta kommer att förändra jagSD vs EG kurva och kan leda till felaktiga resultat och tolkningar. Det är också viktigt att välja VSD och v så att nuvarande är linjärt beroende av VSD och oberoende av v. Om detta inte är fallet, inte kan sedan ekvationerna ovan användas för att beräkna ledningsförmåga.
<…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.D.Y, S.M.G-S. och LMT erkänna Office av marin forskning (Award #N0001415WX01038 och N0001415WX00195), den Naval Research Laboratory och Naval Research Laboratory nanovetenskap Institutet; M.Y.E.-N. stöds av den amerikanska institutionen av energi Grant DE-FG02-13ER16415.
Materials
| IDAs | CH Instruments | 012125 | Manufactured by ALS-Japan; sold by CH Instruments |
| Wire | Digikey | W7-ND | |
| Conductive silver epoxy | Electron microscopy sciences | 12670-EE | |
| Insulating material | 3M | 2131-B | Scotchast flame retardant compound |
| 15 mL conical centrifuge tube | VWR | 89004-368 | |
| 21g needle | VWR | BD-305165 | |
| 5 mL pipette tips | VWR | 82018-842 | |
| 5 mL pipettor | VWR | 89079-976 | |
| Freshwater medium components | Sigma Aldrich | All standard laboratory chemicals | |
| Ammonium chloride | |||
| Sodium phosphate monobasic | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| Artificial seawater medium components | Sigma Aldrich | All standard laboratory chemicals | |
| Sodium chloride | |||
| Magnesium chloride hexahydrate | |||
| Magnesium sulfate heptahydrate | |||
| Potassium chloride | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| Calcium chloride dihydrate | |||
| Ammonium chloride | |||
| Potassium phosphate dibasic | |||
| Ag/AgCl reference electrode | Basi | MF-2079 | |
| Graphite rod counter electrode | Electron microscopy sciences | 70230 | |
| Recirculating water bath | Thermo Scientific | 152-5256 | |
| Bipotentiostat | Pine Instruments | WD-20 | http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user |
| Stir bars | VWR | 58947-114 | |
| G. sulfurreducens culture | ATCC | 51573 | |
| Jacketed reactor | Pine Instruments | RRPG085 |
References
- Boyd, D. A., et al. . Biofilms in Bioelectrochemical Systems. , 177-210 (2015).
- Natan, M. J., Wrighton, M. S. Chemically modified microelectrode arrays. Prog Inorg Chem. 7, 391-494 (1990).
- Paul, E. W., Ricco, A. J., Wrighton, M. S. Resistance of polyaniline films as a function of electrochemical potential and the fabrication of polyaniline-based microelectronic devices. J Phys Chem-US. 89, 1441-1447 (1985).
- Dalton, E. F., et al. Charge transport in electroactive polymers consisting of fixed molecular redox sites. Chem Phys. 141, 143-157 (1990).
- Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Electroactive Polymers and Macromolecular Electronics. Science. 231, 25-31 (1986).
- Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Redox capacity and direct current electron conductivity in electroactive materials. J Phys Chem-US. 90, 1479-1484 (1986).
- Gregoire, K. P., Glaven, S. M., Hervey, J., Lin, B., Tender, L. M. Enrichment of a High-Current Density Denitrifying Microbial Biocathode. J Electrochem Soc. 161, H3049-H3057 (2014).
- Siegert, M., Yates, M. D., Spormann, A. M., Logan, B. E. Methanobacterium dominates biocathodic Archaeal communities in methanogenic microbial electrolysis cells. ACS Sus Chem Eng. 3, 1668-1676 (2015).
- Wang, Z., et al. A previously uncharacterized, nonphotosynthetic member of the Chromatiaceae is the primary CO2-fixing constituent in a self-regenerating biocathode. Appl Environ Microbiol. 81, 699-712 (2015).
- Marshall, C. W., Ross, D. E., Fichot, E. B., Norman, R. S., May, H. D. Long-term Operation of Microbial Electrosynthesis Systems Improves Acetate Production by Autotrophic Microbiomes. Environ Sci Technol. 47, 6023-6029 (2013).
- Strik, D. P. B. T. B., Picot, M., Buisman, C. J. N., Barrière, F. pH and Temperature Determine Performance of Oxygen Reducing Biocathodes. Electroanalysis. 25, 652-655 (2013).
- Strycharz, S. M., et al. Reductive dechlorination of 2-chlorophenol by Anaeromyxobacter dehalogenans with an electrode serving as the electron donor. Environ Microbiol Report. 2, 289-294 (2010).
- Yates, M. D., et al. Microbial Electrochemical Energy Storage and Recovery in a Combined Electrotrophic and Electrogenic Biofilm. Environ Sci Technol Lett. 4, 374-379 (2017).
- Tender, L. M., et al. Harnessing microbially generated power on the seafloor. Nature Biotechnology. 20, 821-825 (2002).
- Yates, M. D., Siegert, M., Logan, B. E. Hydrogen evolution catalyzed by viable and non-viable cells on biocathodes. Int J Hydrogen Energ. 39, 16841-16851 (2014).
- Fokina, O., Eipper, J., Winandy, L., Kerzenmacher, S., Fischer, R. Improving the performance of a biofuel cell cathode with laccase-containing culture supernatant from Pycnoporus sanguineus. Bioresource Technol. 175, 445-453 (2015).
- Yates, M. D., et al. Thermally activated long range electron transport in living biofilms. Phys Chem Chem Phys. 17, 32564-32570 (2015).
- Yates, M. D., et al. Measuring conductivity of living Geobacter sulfurreducens biofilms. Nat Nano. 11, 910-913 (2016).
- Snider, R. M., Strycharz-Glaven, S. M., Tsoi, S. D., Erickson, J. S., Tender, L. M. Long-range electron transport in Geobacter sulfurreducens biofilms is redox gradient-driven. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 15467-15472 (2012).
- Strycharz-Glaven, S. M., Snider, R. M., Guiseppi-Elie, A., Tender, L. M. On the electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms. Energ Environ Sci. 4, 4366-4379 (2011).
- Malvankar, N. S., Tuominen, M. T., Lovley, D. R. Comment on “On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms” by S. M. Strycharz-Glaven, R. M. Snider, A. Guiseppi-Elie and L. M. Tender, Energy Environ. Sci., 2011, 4, 4366. Energy Environ. Sci. 5, 6247-6249 (2012).
- Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nanotechnol. 6, 573-579 (2011).
- Strycharz-Glaven, S. M., Tender, L. M. Reply to the ‘Comment on “On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms”‘ by N. S. Malvankar, M. T. Tuominen and D. R. Lovley, Energy Environ. Sci., 2012, 5. Energy Environ. Sci. 5, 6250-6255 (2012).
- Strycharz-Glaven, S. M., et al. Electron Transport through Early Exponential-Phase Anode-Grown Geobacter sulfurreducens Biofilms. Chem Electro Chem. 1, 1957-1965 (2014).
- Chidsey, C. E., Feldman, B. J., Lundgren, C., Murray, R. W. Micrometer-spaced platinum interdigitated array electrode: fabrication, theory, and initial use. Anal Chem. 58, 601-607 (1986).
- Li, C., Lesnik, K. L., Fan, Y., Liu, H. Redox Conductivity of Current-Producing Mixed Species Biofilms. PLOS ONE. 11, e0155247 (2016).
- Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nano. 6, 573-579 (2011).
- Ing, N. L., Nusca, T. D., Hochbaum, A. I. Geobacter sulfurreducens pili support ohmic electronic conduction in aqueous solution. Phys Chem Chem Phys. 19, 21791-21799 (2017).
- Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energ Environ Sci. 1, 144-147 (2008).
- Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl Environ Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
- Kankare, J., Kupila, E. -. L. In-situ conductance measurement during electropolymerization. J Electroanal Chem. 322, 167-181 (1992).
- Byun, H. S., Pirbadian, S., Nakano, A., Shi, L., El-Naggar, M. Y. Kinetic Monte Carlo Simulations and Molecular Conductance Measurements of the Bacterial Decaheme Cytochrome MtrF. Chem Electro Chem. 1, 1932-1939 (2014).
- El Kasmi, A., Wallace, J. M., Bowden, E. F., Binet, S. M., Linderman, R. J. Controlling interfacial electron-transfer kinetics of cytochrome c with mixed self-assembled monolayers. J Am Chem Soc. 120, 225-226 (1998).
- Bortolotti, C. A., et al. The Reorganization Energy in Cytochrome c is Controlled by the Accessibility of the Heme to the Solvent. J Phys Chem Lett. 2, 1761-1765 (2011).
- Gallaway, J. W., Calabrese Barton, S. A. Kinetics of Redox Polymer-Mediated Enzyme Electrodes. J Am Chem Soc. 130, 8527-8536 (2008).
- Thackeray, J. W., White, H. S., Wrighton, M. S. Poly(3-methylthiophene)-coated electrodes: optical and electrical properties as a function of redox potential and amplification of electrical and chemical signals using poly(3-methylthiophene)-based microelectrochemical transistors. J Phys Chem-US. 89, 5133-5140 (1985).
- Jugnet, Y., Tourillon, G., Duc, T. M. Evidence of Intrinsic Extended π-Bonding Band and Metalliclike Behavior in Undoped and Doped Electropolymerized Poly (3-methylthiophene) Films. Phys Rev Lett. 56, 1862-1865 (1986).
