Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen
Summary
Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.
Abstract
Circadiane klokken zijn functioneel in alle lichtgevoelige organismen, waardoor een aanpassing aan de buitenwereld door te anticiperen op de dagelijkse veranderingen in het milieu. Aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van de nauwe verbinding tussen de circadiane klok en de meeste aspecten van de fysiologie is geboekt op het gebied van de afgelopen tien jaar. Echter, het ontrafelen van de moleculaire basis dat de functie van de circadiane oscillator mens grondslag blijft de hoogste technische uitdaging. Hier bieden we een gedetailleerde beschrijving van een experimentele benadering voor de lange termijn (2-5 dagen) bioluminescentie opname en uitstroom medium collectie in gekweekte menselijke primaire cellen. Hiervoor hebben we primaire cellen getransduceerd met een lentivirale luciferase reporter die onder besturing van een centrale klok genpromotor, waardoor de parallelle beoordeling hormoonsecretie en circadiane bioluminescentie. Verder beschrijven we de voorwaarden voor het verstoren van de circadiane klok in primary menselijke cellen door transfectie siRNA gericht KLOK. Onze resultaten op circadiane regulatie van de insuline secretie door menselijke pancreatische eilandjes en Myokine secretie door humane skeletspiercellen, worden hier gepresenteerd aan de toepassing van deze methode te illustreren. Deze instellingen kunnen worden gebruikt om de moleculaire samenstelling van menselijke perifere klokken bestuderen en de functionele gevolgen primaire cellen onder fysiologische of pathofysiologische condities analyseren.
Introduction
Het circadiane systeem (van het Latijnse "Circa diem") is ontstaan in alle lichtgevoelige organismen, als een adaptief mechanisme om de rotatie van de Aarde. Bij zoogdieren wordt georganiseerd in een hiërarchische wijze, omvat de centrale klok, meer bepaald in de suprachiasmatische nucleus van de ventrale hypothalamus en perifere (of slave) oscillatoren die werkzaam in verschillende organen. Bovendien zijn deze cellen autonome zichzelf onderhoudende oscillatoren zijn functioneel in vrijwel elke cel van het lichaam 1. Fotische signalen vormen een dominante synchronisatie cue (Zeitgeber) voor de SCN neuronen, terwijl neurale en humorale signalen afkomstig van de SCN reset de perifere klokken. Daarnaast slaap-waak ritme, dat rijdt op zijn beurt voeden-vasten cycli, zijn verdere synchronizers voor perifere klokken 2. Volgens onze huidige kennis, wordt de moleculaire samenstelling van de kern klok op basis van transcriptie en translanele feedback loops, die zijn geconserveerd tussen organismen. Dit bestaat uit de transcriptie activatoren BMAL1 en klok, die samen de transcriptie van de negatieve core clock PER en CRY genen te activeren. Hoge niveaus van PER en CRY eiwitten zullen hun eigen transcriptie remmen door remming van de BMAL1 / KLOK complex. Een extra lus bestaat uit de nucleaire receptoren REV-Erbs en Rors, die ook de transcriptie van BMAL1 en KLOK reguleren. Bovendien posttranslationele evenementen, waaronder fosforylering, sumoylation, acetylering, O-GlcNAcylation, afbraak- en nucleaire binnenkomst van de core clock eiwitten vertegenwoordigen een bijkomende belangrijke regulerende laag bij het vaststellen van de 24 uurs oscillatie cyclus 3.
Accumuleren bewijsmateriaal komt voort uit studies in diermodellen en wijst op de cruciale rol van het circadiaan systeem in de coördinatie van de metabole en endocriene functies 4-5. Een aantal van de large-schaal transcriptoom analyse blijkt dat het voeden – vasten cycli een centrale rol in de synchronisatie van perifere oscillatoren 6-8 te spelen. In een overeenkomst met deze studies, metaboloom en lipidomic analyse bij knaagdieren en mensen hebben aangetoond dat een groot aantal metabolieten oscilleren in het weefsel, plasma en speeksel in een circadiane manier 9-11. Belangrijk is dat de meeste hormonen vertonen circadiane ritmes in het bloed 5,12-13. Bovendien zou circadiane klok van de overeenkomstige hormoon producerende perifere weefsels hormoon lokaal te regelen. Cel-autonome circadiane oscillatoren zijn beschreven in knaagdieren en menselijke pancreatische eilandcellen: 14-16. Deze oscillatoren spelen een essentiële rol in het reguleren van de eilandjes van Langerhans transcriptoom en functie 15,17-18. Bovendien Myokine secretie door menselijke skelet myotubes is onlangs aangetoond dat een circadiaan patroon, dat wordt gereguleerd door de cel-autonome oscillato vertonenrs werkzaam in 19 deze cellen.
Verschillende benaderingen voor het bestuderen van circadiane ritmes bij mensen in vivo zijn op grote schaal gebruikt. Zo hebben plasma melatonine of cortisol en thoracale huid oppervlaktetemperatuur (besproken in referenties 3,20) onderzocht endogene circadiane klok beoordelen. Hoewel deze methoden is het mogelijk het bestuderen systemische circadiane oscillaties in vivo, zijn ze verre van een betrouwbare beoordeling van de free-running autonome circadiane ritmes in verschillende organen en weefsels. Niettemin zouden dergelijke dissectie van de systemische regeling een onmisbaar hulpmiddel om het specifieke effect van intracellulaire moleculaire klok op de functie van deze cellen. Daarom heeft aanzienlijke inspanningen ondernomen om betrouwbare methoden voor het bestuderen van humane klokken in geïmmortaliseerde primaire of gekweekte cellen gesynchroniseerd in vitro te ontwikkelen. Belangrijker is aangetoond datklok kenmerken gemeten in gekweekte primaire huid fibroblast cellen sluiten nauw aan bij de individuele klok eigenschappen van het hele organisme 21. De ontwikkeling van fluorescente en bioluminescente circadiane verslaggevers is sterk gevorderd deze benadering 22-27. Verder bestuderen primaire cel klokken die zijn afgeleid van andere perifere organen maakt het onderzoek naar de moleculaire eigenschappen van menselijk weefsel-specifieke klokken 3,5,16,19-20,28. Zo, de beoordeling van de circadiane klok in in vitro gesynchroniseerd primaire explantaten of cellen, met behulp van bioluminescente verslaggevers, vertegenwoordigt een zeer bruikbare methode om de moleculaire samenstelling van humane perifere klokken en hun impact op orgaanfunctie te bestuderen.
In dit artikel zullen we gedetailleerde protocollen te presenteren voor de beoordeling van circadiane genexpressie in humane primaire eilandje en skeletspier cellen gesynchroniseerd in vitro, evenals de impact van de autonome cellulaire klokverstoring van de secretoire functie van deze cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven experimentele instellingen bestaan uit lentivirale levering van circadiane bioluminescentie reporters in gekweekte humane primaire cellen, gevolgd door achtereenvolgende in vitro synchronisatie en continue registratie van bioluminescentie enkele dagen en parallelle analyse van hormoon door dezelfde cellen. Zij vertegenwoordigen een efficiënte aanpak voor het verkennen van de moleculaire mechanismen en functionele aspecten van circadiane klokken in menselijke primaire cellen.
<p class="jo…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar dat onze collega's van de Universiteit van Genève: Jacques Philippe constructieve reacties op dit werk, Ueli Schibler voor onschatbare hulp bij de ontwikkeling van het perifusion systeem en voor de wetenschappelijke inspiratie, André Liani voor hebben bedacht ontwerp, de fabricage en inbedrijfstelling van de perfusie-systeem, Lesa-Technology LTD voor de hulp in de perifusion systeem en Drip-biolumicorder software development, George Severi voor hulp bij de perifusion experimenten, Ursula Loizides-Mangold voor het kritisch lezen van het manuscript, en Anne-Marie Makhlouf voor lentivirus bereidingen ; Etienne Lefai, Stéphanie Chanon en Hubert Vidal (INSERM, Lyon) voor het bereiden van humane primaire myoblasten; en Domenico Bosco en Thierry Berney (Human Islet Transplantation Center, Genève Universitair Ziekenhuis) voor het leveren van menselijke eilandjes. Dit werk werd gefinancierd door de Swiss National Science Foundation Grant No. 31003A_146475 / 1, de Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No. CRSII3-154405, Fondation Romande pour la Recherche sur Diabète, Bo Hjelt Foundation, Fondation Ernst et Lucie Schmidheiny en Société Académique de Genève (CD).
Materials
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate – glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch | |
References
- Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
- Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
- Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
- Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
- Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
- Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
- McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
- Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
- Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
- Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
- Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
- Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
- Hastings, M., O’Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
- Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
- Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
- Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
- Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
- Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
- Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
- Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
- Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
- Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
- Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
- Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
- Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
- Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
- Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
- Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).
