도구 나선 왜곡, 사이트 별 DNA Interstrand 가교의 처리에 건축 단백질 HMGB1의 역할을 연구하는
Summary
Targeted DNA damage can be achieved by tethering a DNA damaging agent to a triplex-forming oligonucleotide (TFO). Using modified TFOs, DNA damage-specific protein association, and DNA topology modification can be studied in human cells by the utilization of modified chromatin immunoprecipitation assays and DNA supercoiling assays described herein.
Abstract
높은 이동성 그룹 상자 1 (HMGB1) 단백질은 전사, DNA 복제 및 DNA 수선 등 게놈 많은 중요한 기능을 조절에 관여하는 히스톤 비 구조적 단백질이다. HMGB1은 정식 B-DNA보다 더 높은 친화력과 구조적으로 왜곡 된 DNA에 결합한다. 예를 들어, 우리는 HMGB1은 DNA가 나선의 왜곡을 야기 공유 결합 DNA의 두 가닥을 연결 가교 (ICLS)를 interstrand, 왼쪽 경우 복구되지 않은 세포 사망을 일으킬 수에 결합하는 것을 발견했다. 때문에 자신의 세포 독성 잠재력, 여러 ICL 유도 에이전트는 현재 병원에서 화학 요법 제로서 사용된다. ICL-형성 제는 특정 염기 서열 (예, '- TA-3 5'는 소 랄렌에 대한 선호 가교 사이트)에 대한 환경 설정을 표시하는 동안, 그들은 크게 무차별 방식으로 DNA 손상을 유도한다. 그러나, 공유 결합 서열 – 특이 적으로 DNA에 결합하는 삼중 – 형성 올리고 뉴클레오티드 (TFO)에 ICL 유도제를 연결함으로써방법은 타겟 DNA 손상이 달성 될 수있다. 여기서는 도구로 사용할 돌연변이 리포터 플라스미드의 부위 특이 ICL을 생성하는 공유 8 trimethylpsoralen (HMT) 랄렌 5 '은 4'- 히드 록시 메틸 4,5'말단에 컨쥬 게이션 TFO를 사용 인간의 세포에서 HMGB1에 의해 복잡한 DNA 병변의 건축 변경, 처리 및 수리를 공부합니다. 우리는 실험 기술 리포터 플라스미드에 TFO 지시 ICLS을 준비하고, 염색질 면역 침전 분석법을 사용하여 휴대 맥락에서 TFO 지시 ICLS와 HMGB1의 연결을 심문에 대해 설명합니다. 또, HMGB1 의해 소라렌 가교 플라스미드 도입 superhelical 회전의 양을 측정함으로써 손상된 DNA의 특정 구조적 변형을 평가하기 위해 수퍼 코일 DNA의 분석을 설명한다. 이러한 기술은 TFO 지시 ICLS 또는 관심있는 세포주 다른 타겟 DNA 손상의 복구 처리에 관여하는 다른 단백질의 역할을 연구하기 위해 이용 될 수있다.
Introduction
삼중 나선 구조를 형성하는 1-5 훅 스틴 수소 결합을 통해 서열 – 특이 적 방식으로 올리고 뉴클레오티드 (TFOs) 바인드 듀플렉스 DNA를 플렉스가 형성. 플렉스 기술은 이러한 전사, DNA 손상을 복구하고 유전자 타겟팅 (참고 문헌 6-8에서 검토)와 같은 생체 분자 메커니즘의 다양한 심문 사용되고있다. TFOs는 리포터 플라스미드 9,10-에 부위 – 특이 적 손상을 유도하기 위해 널리 사용되어왔다. 우리의 실험실과 다른 사람은 이전에 플라스미드 pSupFG1 5,10-12에 supF 유전자에 사이트 별 DNA의 interstrand의 가교 (ICLS)을 유도하기 위해 소 랄렌 분자에 닿는 TFO, AG30을 사용하고 있습니다. ICLS 이러한 병변 공유 개의 DNA 가닥 가교로서 매우 독성이며, 수리되지두면 유전자 전사를 차단하고, DNA 복제 장치 (13, 14)을 방해 할 수있다. 때문에 독성 잠재력, ICL 유도 화제는 치료에 항암제로 사용되어왔다암 및 기타 질병 15. 그러나, 인간의 세포에서 ICLS의 처리 및 수리가 잘 이해되지 않습니다. 따라서, 인간 세포에서 ICLS의 처리에 관여하는 메카니즘에 대한 이해는 ICL 계 화학 요법의 효능을 개선하는 데 도움이된다. TFO 유도 ICLS 및 수리 중간체는 DNA의 나선 구조에 상당한 왜곡을 야기 할 가능성이있다. 이러한 왜곡은 정규 B 형 이중 DNA 16-20보다 더 높은 친화력으로 왜곡 된 DNA에 결합 건축 단백질에 대한 가능성이 대상입니다. 여기, 우리는 염색질 면역 (칩) 소 랄렌 교 플라스미드에 대한 분석을 통해 인간의 세포에서 ICLS와 매우 풍부한 건축 단백질 협회, HMGB1을 공부하고 인간의 소 랄렌 가교 플라스미드 DNA의 토폴로지를 변조에 HMGB1의 역할을 확인 암 세포 용 해물.
HMGB1은 매우 풍부하고 재하 표현이 아닌 자신의정규 B 형 DNA 17-20보다 더 높은 친화력으로 손상된 DNA와 대안 구조화 된 DNA 기판에 결합 톤 건축 단백질. HMGB1 그러한 전사, DNA 복제 및 DNA 수선 16,21-23 여러 DNA 대사 과정에 관여한다. 우리는 이전에 HMGB1 높은 친 화성 (20)와 체외에서 TFO 지시 ICLS에 결합하는 것을 증명하고있다. 또한, 우리는 HMGB1의 부족 뉴클레오티드 절단 수리 (NER) 보조 인자 (23, 24)로 TFO 지시 ICLS의 돌연변이 처리 및 확인 HMGB1 증가 있음을 증명하고있다. 최근에, 우리는 HMGB1는 인간의 세포에서 TFO 지시 ICLS과 관련된 이러한 병변의 채용은 NER 단백질, XPA (16)에 의존하는 것을 발견했다. DNA의 음의 수퍼 코일은 NER (25)에 의해 DNA 병변의 효율적인 제거를 촉진하기 위해 표시되었습니다, 우리는 HMGB1는 TFO 지시 ICL 함유 플라스틱으로에 우선적으로 부정적인 수퍼 코일을 유도하는 것을 발견했다NER 공동 인자로서 HMGB1의 잠재적 인 역할 (들)에 대한 이해를 제공한다 (비 손상된 플라스미드 기판에 대해) 중간 기판 (16). ICLS의 처리는 완전한 인간 세포에서 알려져 있지 않다; 따라서, 본 명세서에 기재된 분자 도구에 기초한 기술과 개발 분석 차례로 암 화학 요법의 효능을 향상시키기 위해 이용 될 수있는 바와 같이 약물 표적을 제공 할 수있다 ICL 수리에 관련된 추가적인 단백질의 동정을 초래할 수있다.
여기서, 효과적인 방법은 논의 된 아가 로스 겔 전기 영동을 변성하여 플라스미드 DNA의 TFO 지시 ICL 형성의 효율성을 평가. 또한, TFO 지시 ICLS를 포함하는 플라스미드를 사용하는 기술이 설명되었다 변성 칩 어 세이를 이용하여 셀룰러 환경에서 ICL 손상된 플라스미드 HMGB1 연관을 결정한다. 또한, 손쉬운 방법은 제 도입 위상 수정을 공부구체적으로는 인간 세포 용 해물에서 ICL 손상된 플라스미드 기판상의 전자 구조적 단백질 HMGB1은 이차원 아가 로스 겔 전기 영동을 통해 수퍼 코일 분석을 수행함으로써 측정되었다. 설명 된 기술은 인간 세포에서 플라스미드의 타겟 DNA 손상 처리에 DNA 수리 및 구조적 단백질 관여의 이해를 촉진하기 위해 사용될 수있다.
우리는 플라스미드 DNA, 이후 플라스미드 칩 각각 DNA 토폴로지 변경 병변과 연관 단백질 및 단백질을 확인하는 분석을 수퍼 코일에 TFO 지시 부위 특이 랄렌 ICLS의 형성에 대한 상세한 프로토콜을 설명한다. 이러한 분석은 다른 DNA 손상 제, TFOs 플라스미드 기판 및 관심 포유 동물 세포 라인을 수행하도록 변형 될 수있다. 사실, 우리는 적어도 하나의 전위와 친 화성이 높은 고유 TFO 결합 부위는 인간 게놈 26의 모든 주석 유전자 내에 있다는 것을 보여 주었다. 방법우리 케르 및 바스, 2016 (16)에 이용되는 것처럼 지금까지, 명확성을 위해, 우리는 인간 U2OS 세포에서 특정 돌연변이 리포터 플라스미드 (pSupFG1)의 특정 랄렌 공역 TFO (pAG30)의 사용을위한 이러한 기술을 설명했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
TFO 지시 ICLS의 효율적 형성이 중요한 요인에 따라 달라집니다 : 목표에 TFO의 결합 친화도에 따라 그 대상 DNA의 기판과의 TFO의 배양, 적절한 버퍼 구성 요소 (예를 들어,의 MgCl 2) 첫 번째 시간 (종속 이중 및 농도)를 사용; 둘째, UVA의 적절한 투여 량 (365 ㎚)을 조사 효율적 소라렌 가교 결합을 형성한다. 최적 삼중 형성 HPLC 또는 겔 정제 TFOs를 사용함으로써 달성 될 수있다. TFO 오염 불순…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 도움이 토론 바스케즈 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 [KMV하는 CA097175, CA093279] 건강 / 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 국립 연구소에 의해 지원되었다; 암 예방 및 텍사스 연구소 [RP101501]합니다. 오픈 액세스 요금 자금 : 국립 연구소 건강 / 국립 암 연구소 [KMV에 CA093279].
Materials
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Certified Reagent Co., Midland, TX | Custom order | HPLC (or gel) purified |
| Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit | Cell signaling Inc. | 9003 | Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR master mix |
| HMGB1 antibody | Abcam | Ab18256 | |
| Wizard Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9281 | |
| Chloroquine-diphosphate salt | Sigma | C6628-50G | For two-dimensional agarose gel electrophoresis |
| EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| GenePORTER transfection reagent | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Blak-Ray long wave ultraviolet lamp | Upland, CA | B 100 AP | UVA lamp |
| EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Water bath sonicator |
| Mylar filter | GE Healthcare Life Sciences | 80112939 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD | XRS+ system | DNA imaging system |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| 37% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Used for crosslinking |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Cell culture media |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Cell culture |
| Bromocresol green | Sigma-Aldrich | 114-359 | DNA loading dye |
| Siliconized tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | Low retention microfuge tube |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP24731 | |
| Photometer | InternationalLight Technologies | ILT1400-A | UVA dose measurement |
| Cell lines | |||
| Human U2OS osteosarcoma | ATCC | ATCC HTB-96 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Human cervical adenocarcinoma HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Cultured according to supplier’s recommendation |
| Proximal forward primer | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Proximal reverse primer | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Distal forward primer | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Distal reverse primer | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
References
- Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
- Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science. 241, 456-459 (1988).
- Beal, P. A., Dervan, P. B. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science. 251, 1360-1363 (1991).
- Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).
- Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).
- Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis. Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).
- Chin, J. Y., Glazer, P. M. Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides. Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).
- Seidman, M. M., Glazer, P. M. The potential for gene repair via triple helix formation. J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).
- Vasquez, K. M. Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks. Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).
- Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).
- Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair. Science. 271, 802-805 (1996).
- Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis. Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).
- Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner. Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).
- Vare, D., et al. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells. DNA repair. 11, 976-985 (2012).
- Huang, Y., Li, L. DNA crosslinking damage and cancer – a tale of friend and foe. Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).
- Mukherjee, A., Vasquez, K. M. HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells. Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).
- Bidney, D. L., Reeck, G. R. Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins. Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).
- Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science. 243, 1056-1059 (1989).
- Jung, Y., Lippard, S. J. Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA. Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).
- Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA. Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).
- Das, D., Scovell, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex. J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).
- Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA. Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).
- Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).
- Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks. DNA repair. 8, 865-872 (2009).
- Park, J. Y., Ahn, B. Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo. FEBS letters. , 174-178 (2000).
- Wu, Q., et al. High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes. Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).
- Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).
- Betous, R., et al. Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells. Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).
- Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).
- Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).
- Puri, N., et al. Minimum number of 2′-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides. Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).
- Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy. Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).
- Boulware, S. B., et al. Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer. Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).
