Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Verktyg för att studera betydelsen av Architectural Protein HMGB1 i behandlingen av Helix snedvrida, Platsspecifik DNA Interstrand tvärbindningar

Published: November 10, 2016 doi: 10.3791/54678
Automatic Translation
1, 1
1Division of Pharmacology and Toxicology, College of Pharmacy, The University of Texas at Austin

Abstract

Hög rörlighet grupprutan 1 (HMGB1) proteinet är en icke-histon arkitektoniska protein som är involverat i regleringen av många viktiga funktioner i genomet, såsom transkription, DNA-replikation och DNA-reparation. HMGB1 binder till strukturellt förvrängd DNA med högre affinitet än till kanoniska B-DNA. Till exempel, fann vi att HMGB1 binder till DNA interstrand tvärbindningar (ICLs), som kovalent länkar de två delarna av DNA vålla snedvridning av spiralen, och om de lämnas oreparerade kan orsaka celldöd. På grund av deras cytotoxiska potential, finns flera ICL-inducerande medel som för närvarande används som kemoterapeutiska medel i kliniken. Medan ICL-bildande medel visar preferenser för vissa bassekvenser (t.ex. 5'-TA-3 'är den föredragna tvärbindningsställe för psoralen), de i hög grad inducerar DNA-skada i en urskillningslös sätt. Men genom att kovalent koppla ICL-inducerande medel till en triplex-bildande oligonukleotid (TFO), som binder till DNA i ett sekvensspecifiktsätt, kan uppnås målinriktad DNA-skada. Här använder vi en TFO kovalent konjugerat på 5 'änden till en 4'-hydroximetyl-4,5', 8-trimetylpsoralen (HMT) psoralen för att generera en platsspecifik ICL på en mutation-reporterplasmid för att använda som ett verktyg att studera arkitektoniska modifiering, bearbetning, och reparation av komplexa DNA-skador av HMGB1 i humana celler. Vi beskriver experimentella tekniker för att förbereda TFO riktade ICLs på reporter plasmider och förhöra den sammanslutning av HMGB1 med TFO riktade ICLs i ett cellulärt sammanhang med hjälp av kromatin immunoprecipitation analyser. Dessutom beskriver vi DNA supercoiling analyser för att bedöma specifika arkitektoniska modifiering av den skadade DNA genom mätning av mängden superhelixvarv introduceras på psoralen-tvärbunden plasmid genom HMGB1. Dessa tekniker kan användas för att studera rollerna av andra proteiner involverade i bearbetning och reparation av TFO-riktade ICLs eller andra riktade DNA-skada i någon cellinje av intresse.

Introduction

Triplex-bildande oligonukleotider (TFOs) binder duplex-DNA på ett sekvensspecifikt sätt via Hoogsteen-vätebindning för att bilda trippelspiralstrukturer 1-5. Triplex teknik har använts för att förhöra en mängd biomolekylära mekanismer, såsom transkription, DNA-skador reparation och genmålsökning (granskas i referenserna 6-8). TFOs har använts i stor utsträckning för att framkalla platsspecifika skador på reporterplasmider 9,10. Vårt laboratorium och andra har tidigare använt en TFO, VT30, bundna till en psoralen molekyl för att framkalla platsspecifika DNA interstrand tvärbindningar (ICLs) i supF-genen på plasmiden pSupFG1 5,10-12. ICLs är mycket cytotoxiska eftersom dessa skador kovalent tvärbinda de två DNA-strängarna, och om de lämnas utan reparation, kan blockera gentranskription och hindra DNA-replikation maskiner 13,14. På grund av deras cytotoxiska potential har ICL-inducerande medel använts som kemoterapeutiska läkemedel för behandlingav cancer och andra sjukdomar 15. Emellertid är bearbetning och reparation av ICLs i humana celler inte väl förstådd. Således kan en bättre förståelse av de mekanismer som är involverade i behandlingen av ICLs i humana celler bidra till att förbättra effektiviteten hos ICL-baserade kemoterapeutiska regimer. TFO-inducerade ICLs och deras reparationsmellan har potential att orsaka betydande strukturella snedvridning av DNA-spiralen. Sådan snedvridning är troliga mål för arkitektoniska proteiner, som binder till snedvriden DNA med högre affinitet än till kanonisk B-formen duplex-DNA 16-20. Här studerade vi föreningen av en mycket riklig arkitektonisk protein, HMGB1 med ICLs i humana celler via kromatin immunoprecipitation (chip) analyser om psoralen-tvärbundna plasmider och identifierade en roll för HMGB1 vid modulering av topologin av psoralen-tvärbunden plasmid-DNA i human cancer cellysat.

HMGB1 är en mycket riklig och allmänt utbrett uttryckt icke-hanstonen arkitektoniska protein som binder till skadat DNA och alternativt strukturerade DNA-substrat med högre affinitet än kanonisk B-form av DNA 17-20. HMGB1 är involverat i flera DNA metaboliska processer, såsom transkription, DNA-replikation och DNA-reparation 16,21-23. Vi har tidigare visat att HMGB1 binder till TFO-riktade ICLs in vitro med hög affinitet 20. Vidare har vi visat att bristen på HMGB1 ökade mutagen behandling av TFO-riktade ICLs och identifierade HMGB1 som en nukleotid excision reparation (NER) kofaktor 23,24. Nyligen har vi funnit att HMGB1 är associerad med TFO-riktade ICLs i humana celler och dess rekrytering till sådana lesioner är beroende av NER-proteinet, XPA 16. Negativ supercoiling av DNA har visat att främja en effektiv borttagning av DNA-skador genom NER 25, och vi har funnit att HMGB1 inducerar negativ supercoiling företrädesvis på TFO-riktade ICL-innehållande plasmitten substrat (i förhållande till icke-skadade plasmider substrat) 16, vilket ger en bättre förståelse av den potentiella roll (er) av HMGB1 som en NER co-faktor. Bearbetningen av ICLs är inte helt förstådd i humana celler; således kunde tekniker och analyser utvecklats baserat på de molekylära verktyg som beskrivs här leda till identifiering av ytterligare proteiner involverade i ICL reparation, vilket i sin tur kan tjäna som farmakologiska mål som kan utnyttjas för att förbättra effektiviteten av cancer kemoterapi.

Här, för att en effektiv strategi bedöma effektiviteten av TFO-riktad ICL-bildning i plasmid-DNA genom denaturerande agarosgelelektrofores har diskuterats. Vidare, med användning av de plasmider som innehåller de TFO-riktade ICLs, tekniker för att bestämma associationen av HMGB1 med ICL-skadade plasmider i ett cellulärt sammanhang användning av modifierade ChIP-analyser har beskrivits. Dessutom, till en enkel metod att studera topologiska ändringar som infördes av the arkitektoniska protein HMGB1, särskilt på ICL-skadade plasmid substrat i humana cellysat har bestämts genom att utföra supercoiling analyser via tvådimensionell agarosgelelektrofores. De tekniker som beskrivs kan användas för att öka förståelsen av inblandningen av DNA-reparation och arkitektoniska proteiner vid bearbetning av målinriktad DNA-skada på plasmider i humana celler.

Vi beskriver detaljerade protokoll för bildandet av TFO-riktade platsspecifika psoralen ICLs på plasmid-DNA, och efterföljande plasmid ChIP och supercoiling analyser för att identifiera proteiner som associerar med de lesioner, och proteiner som förändrar DNA-topologi, respektive. Dessa analyser kan modifieras för att utföra med andra DNA-skadande medel, TFOs, plasmid substrat och däggdjurscellinjer av intresse. I själva verket har vi visat att det finns åtminstone ett potentiellt unik och hög affinitet TFO-bindningsställe inom varje kommenterad genen i det humana genomet 26. Hurnågonsin, för tydlighetens skull, beskrev vi dessa tekniker för användning av ett visst psoralen-konjugerat TFO (pAG30) på en specifik mutation-reporterplasmid (pSupFG1) i humana U2OS celler som vi har använt i Mukherjee & Vasquez, 2016 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Framställning av TFO-riktade ICLs på plasmid substrat

  1. Inkubera ekvimolära mängder av plasmid-pSupFG1 10,11-DNA (5 | j, g plasmid-DNA är en bra startpunkt) med psoralen-konjugerad TFO AG30 i 8 pl av triplex bindningsbuffert [50% glycerol, 10 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCb 2] och dH 2 O till en slutlig volym av 40 | il i en brunfärgad röret. Blanda noggrant genom att pipettera upp och ned. Inkubera reaktionen vid 37 ° C vattenbad i 12 h.
  2. Värma upp UVA lampa för att garantera full effekt. Placera triplex reaktion på paraffin film, och placera paraffinfilmen på is under UVA (365 nM) lampa. Placera en Mylar filter mellan lampan och reaktionen.
  3. UVA bestråla för en total dos på 1,8 J / cm2. Lagra proverna vid 4 ° C för vidare användning.
    Varning: Använd lämplig skyddsglasögon och kläder med UVA-strålning.
  4. Linjärisera 200 ng av den ovan framställda plasmiden med reförträngning enzym Eco R1 i en 20 ul total volym med tillverkaren medföljande 10x buffert. Värme denaturerar enzymet under 20 min vid 65 ° C. Snurra proverna i 10 min vid 10000 x g och förvara vid 4 ° C.
  5. Förbereda 50x alkalisk buffert [1,5 M NaOH, 50 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA)]. Tillsätt 0,5 mg agaros till 50 ml dH 2 O. Koka att upplösa agarosen och placera den i ett 50 ° C vattenbad.
  6. Efter att temperaturen av den upplösta agarosen är ned till 50 ° C, tillsätt 1 ml av 50x alkalisk buffert, blanda det och sedan hälla gelén in i gelén facket. Hinna gelén stelna vid rumstemperatur före användning.
  7. Tillsätt 4 | il 0,5 M EDTA till de 20 pl linjäriserade DNA-prov och inkubera i 10 min vid rumstemperatur.
  8. Lägga 6x alkalisk gelladdningsbuffert (300 mM NaOH, 6 mM EDTA, 18% (vikt / volym) med hög molekylvikt polysackarid, 0,06% Bromocresol Green i dH 2 O) till proverna och till en 1 kb DNA-stege.
    OBS: Det är viktigt att använda 6x alkalisk gelladdningsbuffert, se diskussion.
  9. Belastningsprover på gelén i kylrummet och köra över natten i 1x alkalisk buffert (12-16 timmar) vid 3,2 volt per cm. När proverna har kommit in i gelén, placera en glasplatta på toppen av gelén för att förhindra den från att flyta.
  10. Neutralisera proverna genom blötläggning av gelén i neutraliseringsbuffert [1 M Tris-Cl (pH 7,6), 1,5 M NaCl, 3 M natriumacetat (pH 5,2)] under 45 minuter vid rumstemperatur.
  11. Färga gelén för DNA med 4 | il av 1% etidiumbromid (EtBr) i 50 ml vatten under 1 timme vid rumstemperatur. Avfärgning med vatten under 15 minuter. Visualisera DNA: t genom användning av ett avbildningssystem.
    Varning: EtBr är en potent mutagen och kan absorberas genom huden. Undvik direkt kontakt med EtBr.

2. Transfektion och Immunoprecipitation av TFO-riktade ICL-innehållande plasmider i humana celler

  1. Plate 400.000 däggdjursceller (t.ex., U2OS osteosarcoma celler) per 60 mm skål i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) utan antibiotika 24 h före transfektion. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C med 5% CO2.
  2. Före transfektion, varma tillväxtmedia och fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till 37 ° C i ett vattenbad. Värma transfektionsreagens till rumstemperatur.
  3. Inkubera 30 pl transfektionsreagens med 500 | il av 1x tillväxtmedia (mix 1) och 2 ^ g av TFO-riktade ICL-innehållande plasmider i 500 pl 1x tillväxtmedia (blandning 2) i separata 14 ml rundbottenrören under 10 min vid rumstemperatur.
  4. Lägg mix en för att blanda två, blanda väl genom att pipettera upp och ned. Inkubera under 25-30 minuter vid rumstemperatur.
  5. Tvätta cellerna två gånger med varm PBS. Tillsätt transfektion blandningen i en droppvis sätt fördela jämnt i hela plattan av celler. Tillsätt 1 ml tillväxtmedium till plattan och bringa den slutliga volymen till 2 ml. blandar vill. Placera odlingsplattoma i 37 ° C inkubator med 5% CO2 under 4 h.
  6. Ersätta media med 3 ml tillväxtmedium kompletterat med 10% FBS, och inkubera i ytterligare 16 timmar. Använd inte antibiotika.
  7. Behandla cellerna med 80 | il av 37% färskt formaldehyd per platta till en slutlig koncentration av ca 1% och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur i frånvaro av ljus.
    Varning: Formaldehyd är giftigt och bör hanteras i enlighet med dess säkerhetsinstruktioner. Formaldehydexponering kan orsaka skada på hud, ögon och andningsvägar.
  8. Släcka formaldehyd tvärbindning genom tillsats av 300 | il av kyld glycin (medföljer i kommersiellt tillgängliga kit) per platta och inkubering under 5 min. Ta bort materialet och tvätta två gånger med kyld PBS, och sedan samla cellerna genom skrapning i 1 ml kyld (4 ° C) PBS i ett mikrocentrifugrör. Håll proverna på is hela tiden.
  9. Förbereda cellpellets genom centrifugering vid 4 ° C under 5 minuter tillsattes ent 13.400 xg med hjälp av en bordsskiva kyld centrifug. Pipett ut supernatanten och placera cellpelleten på is.
  10. Homogent återsuspendera pelleten i 1 ml kyld (4 ° C) buffert A (medföljer i kommersiellt tillgängliga kit) och inkubera på is under 10 min. Blanda emellanåt genom att vända röret. Pellets celler som tidigare (se steg 2,9 ovan).
  11. Homogent återsuspendera pelleten i 1 ml kyld (4 ° C) buffert B (medföljer i kommersiellt tillgängliga kit) och inkubera på is under 10 min med tillfällig blandning genom invertering. Pelletera celler genom centrifugering som tidigare (se steg 2,9 ovan).
  12. Resuspendera cellerna åter i 200 ^ kylda buffert B. Tillsätt 2 | il mikrokocknukleas (MNas) och inkubera vid rumstemperatur i 10 min. Blanda reaktion ibland genom att ställa röret. Stoppa MNas reaktionen genom att placera röret på is och tillsats av 40 mM EDTA. Pellets celler som tidigare (se steg 2,9 ovan).
  13. Resuspendera cellerna i 100 l 1x kromatin immunoprecipitation buffert (chip) buffert (levereras i kommersiellt tillgängliga kit) kompletterat med proteashämmare cocktail.
  14. Placera återsuspenderade cellerna i ett tunnväggigt mikrofugrör. Sonikera proverna med flytande dem på vattenbad sonikator under 20 s följt av 20 sek inkubation på is. Upprepa sonikering steg 9 gånger för att generera ~ 800-1200 bp fragment.
    1. Till 20 pl av de sonikerade proven tillsätts 3 pl 5 M NaCl och 1 pl RNas A. Blanda väl genom skakning och inkubera vid 37 ° C under 30 minuter. Därefter, tillsätt 2 pl Proteinas K och inkubera i 2 h vid 65 ° C. Rena prover med användning av en PCR-reningskit. Kör prover på 1% agarosgel och visualisera med EtBr.
      OBS! Maximal intensiteten hos den resulterande DNA bör vara eller under 1000 bp.
  15. I tre separata rör, tillsätt 30 pl lysat i en pre-kyld silikoniserat rör och tillsätt sedan 70 ^ il kylt 1x ChIP-buffert med tillsats av proteashämmare. Tillsätt 1 μg av anti-immunglobulin G (IgG), anti-histon H3 (som en positiv kontroll), eller anti-HMGB1 antikroppar till respektive rör. Inkubera över natten i ett kallt rum med kontinuerlig rotation.
  16. Resuspendera protein G pärlor homogent i kylrummet. Tillsätt 4 pl protein G pärlor per rör och inkubera under ytterligare 2-4 timmar i kylrummet med rotation.
  17. Med hjälp av en magnetställning, pelletera pärlorna och avlägsna supernatanten. Tillsätt 200 l 1x ChIP buffert blandas med proteashämmare cocktail till pelleten och tvätta i 5 minuter i kylrummet med rotation. Upprepa tvätta två gånger.
  18. Utför ytterligare en tvätt med hög salthalt 1x ChIP buffert (innehållande 70 mM NaCl).
  19. Resuspendera pellets med 160 | j, l elueringsbuffert (levereras i kommersiellt tillgängliga kit) och inkubera vid 37 ° C med rotation under 30 minuter.
  20. Pellet pärlorna och samla supernatanten i ett nytt rör. Tillsätt 6 pl av 5 M NaCl och 2 | il proteinas K, och inkubera över natten vid 65° C.
  21. Rena DNA med användning av en PCR-produkt-reningskit och eluera DNA med användning av 50 | j, l dH2O
  22. Utför PCR 16 reaktioner med användning av primeruppsättningar till regionen (s) av intresse, och lösa de produkter på en 1% agarosgel färgad med EtBr.

3. supercoiling analys och två-dimensionell agarosgelelektroföres

  1. Förbereda DNA-reparationssyntes-buffert (45 mM Hepes-KOH, pH 7,8; 70 mM KCl; 7,4 mM MgCl2; 0,9 mM DTT; 0,4 mM EDTA; 2 mM ATP, 20 | iM dNTP, 3,4% glycerol och 18 pg bovint serumalbumin) . Förvara vid -80 ° C. Tina på is och före användning tillsätt 40 mM phosphocreatine och 2,5 mikrogram kreatinfosfokinas.
  2. Förbered 10x supercoiling buffert [500 mM Tris (pH 8,0), 500 mM NaCl, 25 mM MgCl2, 1 mM EDTA], och förvara vid rumstemperatur.
  3. Linjärisera 300 ng super plasmid pSupFG1 DNA helt med ett pl Vaccinia Topoisomeras I (5-15 U / ul) med 1xsupercoiling buffert i en 10 pl reaktion. Inkubera blandningen vid 37 ° C under 1 timme.
  4. Tina HeLa cellfritt extrakt 24 på is. Till de helt avslappnad plasmider, tillsätt 25 | il HeLa cellfria extrakt och DNA-reparationssyntes buffert. Blanda väl. Lägga till ytterligare 1 pl av Vaccinia Topoisomeras I till mixen, och inkubera i 1 timme vid 37 ° C.
  5. Avsluta reaktionerna genom tillsättning av natriumdodecylsulfat (SDS) (1% slutlig koncentration) och proteinas K (0,25 mg / ml slutkoncentration). Inkubera vid 65 ° C under 2 h.
  6. Kasta en 1% agarosgel med 1x Tris Borat-EDTA (TBE) buffert. Lägg DNA laddningsfärg och ladda reaktionerna direkt på gelén åtminstone 4 banor isär. Kör gelen för 8-10 h vid 2 V / cm i 1 x TBE (dimension 1) vid rumstemperatur för att lösa de topoisomers.
    OBS: Förbered en 5x TBE stamlösning i 1 liter dH 2 O genom att tillsätta 54 g Tris-bas. 27,5 g borsyra och 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0).
  7. Förbereda 2 L av 1xTBE med 3 | ig / ml klorokin-fosfat. Blöt gelén i 200 ml av denna lösning under 20 min. Täck gelbricka med aluminiumfolie.
  8. Att elektrofores gelén i den andra dimensionen, vrid gel 90 ° medsols och köra det för 4-6 timmar vid 2 V / cm i klorokin innehåller 1x TBE att lösa de positiva och negativa supercoils.
  9. Färga gelén med EtBr under 1 timme på en rocker. Avfärgning gelén med dH 2 O under 15 minuter och därefter visualisera den termiska fördelningen av topoisomers med användning av en imager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bildandet av TFO-directed ICL är kritisk för plasmiden baserade analyser, som används för att förhöra rollerna för arkitektoniska proteiner i ICL bearbetning i humana celler. Denaturerande agarosgelelektrofores är ett enkelt sätt att bestämma effektiviteten i TFO-riktad ICL bildning. De plasmider TFO-riktade ICLs migrerar med en långsammare mobilitet genom agarosgelen matrisen (Figur 1A, bana 3) jämfört med de icke-tvärbundna styr plasmider (Figur 1A, bana 2). Densitometrisk kvantifiering av banden i spår 2 och 3 (figur 1 A) visar ca 70% av den plasmid-populationen vandrar genom gelén med långsammare mobilitet (identifierad med en svart pil), vilket indikerar TFO-directed ICL formation på dessa plasmider.

Kromatin immunoprecipitation analyser utförda på extrakt från human U2OS celler transfected med antingen kontrollplasmid (P) eller plasmider som innehåller TFO-riktade ICLs (P-ICL) show anrikning av HMGB1 vid P-ICL region jämfört med kontrollen (P) region, när immunutfälldes med en anti-HMGB1 antikropp (figur 2 , övre panelen, spår 2 och 3). Dessa resultat indikerar att HMGB1 associerar med de ICLs i mänskliga celler. När HMGB1 utarmades från cellerna via siRNA behandlingen bedömdes P-ICL-specifik anrikning nedsatt (Figur 2, övre panelen, spår 4 och 5), som förväntat. När samma prover immunutfälldes med användning av en anti-IgG-antikropp som en antikropp specificitetskontroll ades ingen PCR-amplifiering detekteras, som förväntat (figur 2, övre panelen banorna 6-10). Banorna 10-14 (övre panelen) i figur 2 var insampel används för normalisering. Den övre panelen visar PCR-förstärkning av primers nära TFO-riktade ICL plats och den nedre panelen visar PCR-förstärkning när primers distala till TFO-riktadeICL site användes.

HMGB1 är en arkitektonisk protein, som binder till snedvriden DNA med högre affinitet än den binder oskadade DNA. DNA supercoiling analyser lösas genom tvådimensionell agarosgelelektrofores visa arkitektoniska modifiering av TFO-riktade ICL-innehållande plasmider (P-ICL) jämfört med kontroll plasmider (P) av HMGB1 i extrakt HeLa cell (Figur 3). Den arkitektoniska modifiering induceras av HMGB1 företrädesvis på P-ICL-innehållande substrat detekteras som ökad negativ supercoiling. Supertvinnade plasmider migrerar snabbare genom agarosgeler relativt avslappnad eller linjära plasmider. Fördelningen av de topoisomers indikerar mer supercoiling av P-ICLs jämfört med P i närvaro av HMBG1 (Figur 3). Negativt super DNA körs som vänsterhänta båge i den andra dimensionen i närvaro av klorokin. Den supercoiling induceras av HMGB1 på P-ICLverkar består främst av topoisomers som bildar en vänsterhänt båge (~ 14 topoisomers identifierades på TFO-riktade ICL innehållande plasmider jämfört med ~ 7 topoisomers från kontroll plasmid), vilket indikerar bildandet av negativa supercoils. Sammantaget tyder dessa data att plasmider med TFO-riktade ICLs kan användas som ett verktyg för att studera hög affinitet sammanslutning av arkitektprotein HMGB1 med DNA-skador i humana celler genom kromatin immunoprecipitation analyser. Dessutom kan specifika arkitektoniska modifieringar av de P-ICL substrat genom HMGB1 också studeras med användning av supercoiling analyser och två-dimensionella agarosgeler.

Figur 1
Figur 1: Alkaline agarosgelelektrofores analys för att kvantifiera TFO-riktade ICL formation effektivitet på plasmiden pSupFG1 (A) Spår 1, 1 kb DNA-stege,. spår 2, plasmid pSupFG1 (P) som används som en kontroll; och bana 3, TFO-riktad ICL-innehållande pSupFG1 (P-ICL). Plasmiderna som hyser ICLs migrerar långsammare i gelén såsom demonstreras i bana 3 (indikeras av den svarta pilen på den högra sidan av gelén). (B) Densitometrisk kvantifiering av banden i spår 2 och spår 3 visar att ca 70% av plasmiderna är tvärbundna. Denna siffra har ändrats från referens 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: ChIP-analysen demonstrerar anrikningen av HMGB1 på TFO-directed ICL-innehållande regionen av den tvärbundna plasmiden (A). PCR-förstärkning av immunfällda fragment resolved på en 1% agarosgel med användning av en uppsättning av proximala primrar nära TFO-directed ICL plats (B; P1 och P2, övre panelen) och en andra uppsättning primrar som används som en specificitetskontroll som var ytterligare (ca 2000 bp) från webbplatsen riktad ICL (B, P3 och P4, nedre panelen). Banorna 2 och 3 indikerar anrikning av HMGB1 nära den TFO-directed ICL (spår 3) i förhållande till oskadade DNA (bana 2). Spår 4 och 5 är antikroppsspecificitet kontroller med hjälp av en IgG-antikropp. Spår 6 och 7 är de inmatade samplen. Bana 8 är en negativ kontroll för PCR-reaktionen och innehåller inget DNA-templat. P, plasmid pSupFG1. P-ICL, TFO-riktad ICL-innehållande plasmid pSupFG1. Denna siffra har ändrats från referens 16. (B) En schematisk bild av plasmiden pSupFG1 visar primer platser för P1 och P2 samt P3 och P4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: 2D agarosgelelektrofores som visar bildandet av negativa supercoils i TFO-riktade ICL-innehållande plasmider, underlättas av HMGB1 The 1x TBE agarosgel avslöjar den termiska fördelningen av topoisomers genereras av plasmiden enbart (P) eller psoralen-tvärbundna. plasmid (P-ICL). Rörligheten av supertvinnade arter snabbare jämfört med den avslappnade plasmider. Varje band representerar en topoisomer som skiljer sig från bandet under eller över genom en mindre eller mer superhelix sväng, respektive. Den vänsterhänta båge representerar negativt super (ve) arter och högerhänt båge representerar positivt super (+ ve) arter. Den psoralen ICL-innehållande plasmid populationen (P-ICL) innehåller mer super arter än kontroll plasmider (P). R, avslappnad plasmider; S, supertvinnade plasmider; 1D,första dimension av gelelektrofores; 2D, andra dimension av gelelektrofores. Denna siffra har ändrats från 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den effektiva bildningen av TFO-riktade ICLs är beroende av två viktiga faktorer: För det första, korrekt buffertkomponenter (t.ex. MgCl2) och tid för inkubation av TFO med dess mål-DNA-substrat (beroende på bindningsaffiniteten hos TFO till sitt mål duplex, och koncentrationerna som används); och andra, den rätta dosen av UVA (365 nm) bestrålning för att bilda psoralen tvärbindningar effektivt. Optimal triplexbildning kan uppnås genom användning av HPLC eller gel renade TFOs. Föroreningar som förorenar TFO kan leda till oönskade tvärbundna produkter, vilket ytterligare kan komplicera den experimentella resultatet. För att öka stabiliteten hos TFOs kovalent bunden till en 5'-HMT psoralen bör TFOs förvaras i alikvoter vid -80 ° C, såsom multipel frysning tining av TFOs kan resultera i nedbrytning av oligonukleotider. Efter triplexbildning att rikta psoralen till ett specifikt ställe (t.ex., 5'-TA-3 'och 5'-AT-3' är preförts psoralen tvärbindningsställen), psoralen ICL formation kräver bestrålning med UVA. En dos på 1,8 J / cm 2 UVA är tillräcklig för optimal bildning av ICLs på plasmider in vitro. Exponeringstiden bör bestämmas med hjälp av en fotometer. Beroende på UVA-lampa källan, förutom att emittera UV vid 365 nm, kan lampan också avger kortare våglängder, vilket kan leda till bildandet av oavsiktlig DNA-skada genom hela DNA-huvudkedjan. Eftersom TFO riktade ICL-innehållande plasmider kommer att användas för studier rörande DNA-reparation av en ICL på en viss plats, kan sådana oavsiktliga fotoprodukter förbrylla resultatet av studierna DNA-reparation. Därför bör en Mylar filter användas för att förhindra exponering av proverna till kortare våglängder. Framgångsrik ICL bildning beror också på stabiliteten i triplex strukturen under UVA-strålning. Tiden för UV-bestrålning som krävs beror på den wattal den UVA-källa. I vårt fall är 20-30 min krävs för att generera the önskade dosen av UVA. Under denna tid kan värme som genereras av lampan orsaka evaporativ vattenförlust från proverna. Sådan vattenförlust kan förändra buffertkoncentrationen och kan orsaka destabilisering av de triplexstrukturer. Placering reaktionerna på is under UVA-strålning kommer att bidra till att förhindra avdunstning av proverna.

För att bestämma effektiviteten av psoralen tvärbindningsbildning på plasmiden substraten proverna löst i 1% alkaliska agarosgeler (fig 1). De flesta protokoll för alkalisk gelelektrofores föreslå en 2x alkalisk gelpåföringsfärgämne, även om vissa protokoll tyder på att alkaliska laddningsfärg är inte nödvändigt, eftersom denatureringsbuffert tillståndet hos gelén är tillräcklig för att denaturera proverna. Medan en 2x färgämne fungerar bra med koncentrerade DNA-prover, kräver detta protokoll laddar en stor provvolym. Använd därför en 6x alkalisk gelpåföringsfärgämne. För att säkerställa korrekt denaturering av psoralen tvärbundna plasmid substrat, inkubera proverna i laddningsbufferten under 10 min vid rumstemperatur. Dessutom, Mg 2+ kan bilda Mg (OH) 2 under alkaliska betingelser, vilket infångar DNA och kan få den att falla ut. Den triplex-bildande reaktionsbuffert innehåller Mg2 +, och därför är det viktigt att inkubera proverna med EDTA för att säkerställa att den Mg2 + kelateras före tillsats av alkaliskt laddningsfärg till proverna. Efter elektrofores, är det viktigt att neutralisera gelén, såsom EtBr inte interkalerar med DNA under alkaliska betingelser.

Ett alternativt tillvägagångssätt för att bedöma effektiviteten hos TFO-riktad tvärbindningsbildning är användning av denaturerande polyakrylamidgelelektrofores, men denna teknik är mer arbetskrävande, och kräver restriktionsdigerering av plasmiderna följt av radioaktiv isotop märkning av fragmenten. Denna nuvarande strategin visar en relativt enkel, men effektiv metod för att determine effektiviteten i TFO-directed ICL formation på plasmid substrat. Emellertid kan denna teknik användas för att bedöma bildningen av ICLs av andra tvärbindningsbildande medel samt.

Framgångsrikt resultat av plasmiden ChIP analysen beror på ett antal faktorer. De kritiska stegen i protokollet och felsökningsförslag diskuteras här. Kritiska steg som ingår i denna analys, innefattar formaldehyd tvärbindning, mikrokocknukleas matsmältning, sonikering, prov tvättar, och återföring av de formaldehyd protein-DNA-tvärbindningar i proven. För effektiv protein-DNA-tvärbindning, är det viktigt att använda färska formaldehyd. Lager flaskor 37% formaldehyd bör inte användas för mer än sex månader efter öppnandet, som exponering för ljus och syre försämrar formaldehyd. Därför är det också fördelaktigt att utföra formaldehydtvärbindning utan ljus i cellodlings huven. Ett annat viktigt steg är mikrokocknukleas (MNas) digestion av proverna. MNas matsmältning inte bara klyver iska DNA i mindre fragment, men också tar bort alla kvardröjande plasmider som inte levererades i cellerna under transfektion metoden, som dramatiskt kan minska bakgrunden. Inkubationstiden av MNas digestion bör bestämmas empiriskt. Längre matsmältning kan leda till förlust av prover, medan kortare inkubationsperioder kan leda till ineffektiv borttagning av oönskat DNA. Utmärkta resultat kan ses efter 10 min inkubation vid rumstemperatur med omblandning då och då av de reaktioner genom att vända rören. För effektiv immunoutfällning, bör DNA fragmenteras till storlekar mellan 800-1200 bp. Sådan fragmentering av DNA kan åstadkommas genom noggrann ultraljudsbehandling av proverna. Effektiv sonikering av prover kan åstadkommas genom att åter suspendera pellets i tunnväggiga PCR-rör och därefter placera dem i ett vattenbad sonikator. Sonic pulser är mer effektiva jämfört med kontinuerlig ultraljudsbehandling. i additjon, är det viktigt att placera proverna på is mellan pulserna för att förhindra proteinnedbrytning, och det är också viktigt att komplettera 1x ChIP buffert med proteasinhibitorer, som stabila proteiner är nödvändiga för antikroppsigenkänning och efterföljande fällningssteg. Emellertid under immunoprecipitation processen, på grund av den hydrofoba naturen hos de magnetiska pärlorna, icke-specifik DNA kommer att dras ned. För att minska signaler från sådana icke-specifika mallar är absolut nödvändigt rigorösa tvätt. Slutligen är nödvändigt för PCR-amplifiering av de immunoprecipiterade mallar korrekt återföring av de protein-DNA-tvärbindningar hos proven. För att uppnå optimala resultat bör proverna inkuberas under minst 12 timmar med SDS och proteinas K. Det finns fördelar med att använda en plasmid-baserad ChIP analys över iska CHIP analyser. Till exempel kan riktad DNA-skada lätt uppnås med användning av en plasmid-DNA-substrat och ett TFO, jämfört med TFO-riktad lesionsbildning i en genomisk locus. amount av substrat kan också styras för att modulera intensiteten hos signaler vid användning av en TFO-riktad skadad plasmid. Vidare kan sådana substrat användas i alla cellinje val och testades för association med olika kandidatproteiner och därmed utvidga omfattningen av studier om behandling och reparation av ICLs.

Den supercoiling analysen är baserad på skillnaden i form mellan linjära och supertvinnad plasmid-DNA. Supertvinnade DNA-plasmider är mer kompakt och migrera snabbare genom gelmatrisen jämfört med avslappnad plasmider. De kritiska stegen i protokollet och felsökningsförslag diskuteras här. Eftersom arkitektoniska proteiner underlättar topologiska ändringar på skadade DNA-substrat, mätt genom induktion av supercoiling av den avslappnade plasmider, är det viktigt att helt slappna av plasmider med Topoisomeras I. Det är nödvändigt att undersöka omfattningen av DNA avkoppling orsakas av topoisomeras I via agarosgel elektrofores.MgCl2 närvarande i supercoiling bufferten kan utfällas med tiden, och närvaron av MgCl 2 påverkar den termiska fördelningen av de positiva och negativa supercoils genom att underlätta bildandet av positiva supercoils. Därför är det fördelaktigt att lägga till MgCl2 separat till mixen eller förbereda färsk buffert varje gång. För att separera topoisomers av plasmiden populationer, är det viktigt att utföra gelelektroforesen på en mycket låg spänning (~ 2 V / cm), så att migrationen av DNA är huvudsakligen baserad på strukturen / form av molekylerna. Om uppmjukning av plasmider från Topoisomeras I är inte komplett, så ska ökas inkubationstid och / eller mängden enzym som används. Fullständig avkoppling måste garanteras innan vi går vidare till nästa DNA supercoiling steg, eftersom användningen av supercoiling analysen med ofullständigt avslappnad plasmider kan leda till feltolkningar av data och resultatet kan vara svårt att replikera. gång komplete avkoppling har uppnåtts, den supercoiling analysen är relativt lätt att utföra. En viktig komponent i denna analys är användningen av en DNA-reparationssyntes buffert. Phosphocreatine och kreatinfosfokinas måste läggas till mixen varje gång för att generera ATP. Efter det att supercoiling steget är det viktigt att ta bort proteiner från plasmid-DNA genom inkubering med SDS och proteinas K. SDS bistår i dissociera proteinerna från DNA och proteinas K degraderar proteinet, som lämnar DNA intakt med olika nivåer av supercoiling . Om proteinet inte tas bort helt och hållet, kommer den termiska fördelningen av topoisomers inte synas tydligt. DNA: t kan inte renas genom fenol: kloroform: isoamylalkohol och utfälldes med etanol eftersom denna metod (och andra) kan nick DNA, vilket resulterar i förlust av supercoiling. Ett annat viktigt steg är tillsats av klorokin till bufferten. Klorokin är ett inskjutande medlet och lindar DNA. Påinskjutning, slappnar den negativt super DNA och introducerar positiv supercoiling till avslappnad DNA som underlättar separation av topoisomers innehåller en hög täthet av supercoiling. Således positiva och negativa supercoils kan differentieras. Detta är i allmänhet en enkel experimentet och är mycket reproducerbar när alla punkter ovan beaktas.

Om emellertid ingen supercoiling är uppenbar, då är det nödvändigt att bestämma aktiviteten av proteinet av intresse. 2D supercoiling analys har använts för att studera topologiska ändringar underlättas av arkitektoniska proteiner 27. Denna analys har använts här i samband med DNA-skada bearbetning av TFO-riktade ICLs i humana celler. HMGB1 binder till TFO-riktade ICLs med hög affinitet och specificitet, såsom tidigare visats via in vitro gelelektroforetiska mobilitetsskiftsanalyser 20 och i humana celler med användning av plasmiden ChIP-analys som beskrivs inom 16. Här, usjunga 2D supercoiling analysen har det visats att vid bindning till TFO-riktade ICLs i HeLa cellfria extrakt, HMGB1 hjälper i bildandet av negativa supercoiling på substraten (Figur 3), vilket kan vara ett viktigt steg i reparation av skadan eftersom negativa supercoiling är känt för att underlätta avlägsnandet av DNA-skada via NER vägen 25. Det finns många arkitektoniska proteiner som har varit inblandade i DNA-skada bearbetning som skulle kunna studeras med denna analys. Detta tillvägagångssätt är begränsat till in vitro-studier, inte desto mindre, är det en enkel och användbar analys för att förfråga struktur-funktionsförhållandet av arkitektoniska proteiner i samband med DNA-skada reparation. Däremot kan chipet protokollet enkelt modifieras för att studera DNA-proteininteraktioner i samband med genomet, medan bedöma effekterna på DNA supercoiling av sådana interaktioner kan visa sig vara ganska svårt. Vi och andra grupper har verkligen performed triplex baserade studier 1) genom stabil transfektion av plasmid-DNA i genomet februari 28-30) genom att rikta en genomisk locus 31-33 och 3) genom att införliva den psoralen-modifierade TFO (och UVA-bestrålning) i celler efter plasmidtransfektion 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Författarna vill tacka medlemmarna i Vasquez laboratorium för bra diskussioner. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA097175, CA093279 att KMV]; och förebyggande av cancer och Forskningsinstitut Texas [RP101501]. Finansiering för open access laddning: National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA093279 till KMV].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5'HMT Psoralen-AG30 Midland Certified Reagent Co., Midland, TX Custom order HPLC (or gel) purified
Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit Cell signaling Inc. 9003 Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.
GoTaq Green Promega M7122 PCR master mix
HMGB1 antibody Abcam Ab18256
Wizard Gel and PCR cleanup kit Promega A9281
Chloroquine-diphosphate salt Sigma C6628-50G For two-dimensional agarose gel electrophoresis
EcoRI New England BioLabs R0101S
GenePORTER transfection reagent Genlantis T201015
Vaccinia Topoisomerase I Invitrogen 38042-024
Blak-Ray long wave ultraviolet lamp Upland, CA B 100 AP UVA lamp
EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 Epigentek EQC-1100 Water bath sonicator
Mylar filter GE Healthcare Life Sciences 80112939
Agarose Sigma-Aldrich A6111
BIO-RAD Chemidoc BIO-RAD XRS+ system DNA imaging system
Glycine Fisher Scientific BP381-500
37% Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775-25ML Used for crosslinking 
Proteinase K New England Biolabs P8107S
DMEM ThermoFisher 11965092 Cell culture media
PBS ThermoFisher 70013073 Cell culture
Trypsin-EDTA ThermoFisher 25200056 Cell culture
Bromocresol green Sigma-Aldrich 114-359 DNA loading dye
Siliconized tubes Fisher Scientific  02-681-320 Low retention microfuge tube
Tris base Fisher Scientific BP152-1
Boric Acid Fisher Scientific A74-1
EDTA Fisher Scientific BP24731
Photometer InternationalLight Technologies ILT1400-A UVA dose measurement
Cell lines
Human U2OS osteosarcoma ATCC ATCC HTB-96 Cultured according to supplier’s recommendation
Human cervical adenocarcinoma HeLa ATCC ATCC-CCL-2 Cultured according to supplier’s recommendation
Proximal forward primer 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Proximal reverse primer 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Distal forward primer 5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Distal reverse primer 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
  2. Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science. 241, 456-459 (1988).
  3. Beal, P. A., Dervan, P. B. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science. 251, 1360-1363 (1991).
  4. Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).
  5. Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).
  6. Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis. Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).
  7. Chin, J. Y., Glazer, P. M. Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides. Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).
  8. Seidman, M. M., Glazer, P. M. The potential for gene repair via triple helix formation. J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).
  9. Vasquez, K. M. Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks. Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).
  10. Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).
  11. Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair. Science. 271, 802-805 (1996).
  12. Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis. Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).
  13. Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner. Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).
  14. Vare, D., et al. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells. DNA repair. 11, 976-985 (2012).
  15. Huang, Y., Li, L. DNA crosslinking damage and cancer - a tale of friend and foe. Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).
  16. Mukherjee, A., Vasquez, K. M. HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells. Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).
  17. Bidney, D. L., Reeck, G. R. Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins. Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).
  18. Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science. 243, 1056-1059 (1989).
  19. Jung, Y., Lippard, S. J. Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA. Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).
  20. Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA. Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).
  21. Das, D., Scovell, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex. J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).
  22. Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA. Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).
  23. Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).
  24. Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks. DNA repair. 8, 865-872 (2009).
  25. Park, J. Y., Ahn, B. Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo. FEBS letters. , 174-178 (2000).
  26. Wu, Q., et al. High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes. Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).
  27. Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).
  28. Betous, R., et al. Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells. Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).
  29. Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).
  30. Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).
  31. Puri, N., et al. Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides. Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).
  32. Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy. Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).
  33. Boulware, S. B., et al. Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer. Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).

Tags

Genetik triplex-bildande oligonukleotid DNA-reparations interstrand DNA tvärbindningar plasmid ChIP analys 2D supercoiling analys HMGB1
Verktyg för att studera betydelsen av Architectural Protein HMGB1 i behandlingen av Helix snedvrida, Platsspecifik DNA Interstrand tvärbindningar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Tools… More

Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks. J. Vis. Exp. (117), e54678, doi:10.3791/54678 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter