Una tecnica innovativa per la generazione e Observing Chemiluminescenza in un ambiente biologico
Summary
This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.
Abstract
Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.
Introduction
Negli ultimi decenni, le tecnologie di imaging hanno rivoluzionato il modo in cui i medici a diagnosticare e monitorare la malattia. Queste tecnologie di imaging, tuttavia, sono stati in gran parte limitato a sistemi di imaging di tutto il corpo, come la tomografia ad emissione di positroni (PET), singolo fotone-emissione di tomografia computerizzata (SPECT), tomografia computerizzata (TC) e la risonanza magnetica (MRI). Particolare attenzione è stata dedicata al cancro, e innovazioni tecnologiche di imaging hanno notevolmente migliorato il modo in cui questa malattia è diagnosticata e trattata. Nonostante questi progressi, c'è un posto in cui queste tecnologie di imaging proprio non si adattano: la sala operatoria. Mentre le tecniche di imaging intero corpo può aiutare nella pianificazione chirurgica, che in genere non hanno risoluzioni spaziali alto abbastanza per aiutare i medici a determinare in tempo reale se tutto il tessuto tumorale è stata rimossa o tessuto tumorale residuo rimane nascosto ai margini chirurgici 1. Fare in modo che nessun infiltrativamargini del tumore sono lasciati alle spalle è uno dei più importanti obiettivi chirurgici e chirurghi devono camminare una corda tesa tra il rigoroso e prudente la resezione di tessuto. Se troppo viene rimosso, effetti collaterali indesiderati per il paziente sono aggravate; se troppo poco è stato rimosso, i tassi di recidiva sono aumentati 2, 3. Pertanto, è fondamentale per delineare i margini del tumore accurati, e crediamo che l'imaging chemiluminescenza intraoperatoria può contribuire a migliorare l'accuratezza della identificazione dei margini del tumore, aiutando i chirurghi di visualizzare il tessuto maligno che altrimenti potrebbero rimanere inosservato con tecniche consolidate.
Ci sono molte tecnologie di imaging attualmente sotto inchiesta per il loro possibile utilità come sistemi di imaging intraoperatorie. Questi includono beta- e γ-radiazioni che emettono le sonde 4, la fluorescenza ottica 5, spettroscopia Raman 6 </sup>, 7, e Cherenkov luminescenza 8, 9. Fino ad oggi, tuttavia, nessuno di questi si sono affermati come strumenti clinici standard. fluorescenza ottica ha finora dimostrato di essere il più promettente di queste tecniche ed è quindi la più esplorata. Mentre è già dimostrato di essere un valido strumento per molte applicazioni, non è priva di limiti. In effetti, il suo svantaggio principale è la fluorescenza di fondo generato dal tessuto biologico intrinsecamente autofluorescenti. Questo segnale di fondo autofluorescenti è un prodotto della eccitazione del tessuto circostante, oltre al fluoroforo, dalla sorgente di luce esterna necessaria per la generazione di un segnale fluorescente. Dal punto di vista pratico, questo autofluorescenza può potenzialmente portare a bassi rapporti segnale-rumore, che possono limitare l'utilità di questa tecnologia in sala operatoria.
Il principalevantaggio dell'imaging chemiluminescenza sopra fluorescenza è che la luce di eccitazione è necessaria. Di conseguenza, non vi è alcun fondo autofluorescenza. Nell'imaging chemiluminescenza, l'energia di eccitazione viene invece generato chimicamente. Questo processo produce nessun segnale di fondo non volute e quindi può determinare maggiori rapporto segnale-rumore. Ciò potrebbe concludersi con l'individuazione più precisa ed accurata dei margini chirurgici. Un po 'a sorpresa, l'utilità di questo approccio come una tecnica di imaging intraoperatorio è rimasto inesplorato 10. Infatti, l'esempio più vicino a questa tecnica è l'ossidazione del luminolo da mieloperossidasi nei topi 11, 12, 13. Chemiluminescent di imaging biomedico è quindi una zona piuttosto inesplorato di ricerca che potrebbe offrire i seguenti vantaggi: (1) autofluorescenza minimo con un conseguente basso segnale di fondo con hirapporti Gher segnale-rumore; (2) lunghezze d'onda sintonizzabili di emissioni chemiluminescenti che vanno dal visibile al vicino infrarosso; e (3) functionalizable complessi chemiluminescenza che, quando combinato con le tecnologie linker e biomolecole che già esistono mirati, forniscono l'accesso a intere biblioteche di sonde di imaging molecolare mirati 14.
Questo studio prova di principio illustra la potenziale utilità dell'imaging chemiluminescente nella cornice biomedica utilizzando un agente di imaging a base di rutenio. Le proprietà chemiluminescenti di questo composto sono ben studiati, con indagini risalenti alla metà del 1960 15. All'attivazione chimica, l'agente produce luce a circa 600 nm 16, che è adatto per scopi di imaging medicale. L'energia di attivazione è fornita da una reazione redox che porta ad un eccitato allo stato che ha una durata di 650 ns in acqua 17 -folldovuto dalla generazione di fotoni su rilassamento di questo stato eccitato. Attraverso l'uso di un nebulizzatore remota apposito, siamo stati in grado di rilevare il composto sia ex vivo e in vivo. I risultati degli esperimenti iniziali sono molto promettenti, suggerendo ulteriori indagini di questa tecnologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo presentato una tecnologia capace di delineare otticamente tessuto tramite l'emissione di fotoni create da un reporter chemiluminescente. A differenza di altri, più stabilito, tecnologie 4, 5, 6, 7, 8, 9, questo sistema reporter chemiluminescenza impiega una sonda immagini che non radioattivo e facilita il r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Prof. Jan Grimm and Mr. Travis Shaffer for their helpful discussions and Mr. David Gregory for editing the manuscript. Technical services provided by the MSK Animal Imaging Core Facility, supported in part by NIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48, are gratefully acknowledged. The authors thank the NIH (K25 EB016673 and R21 CA191679, T.R. and 4R00CA178205-02, B.M.Z.), the MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (T.R.), the Tow Foundation (B.C.), and the National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 at Hunter College for B.C. and T.M.S.) for their generous support. The research reported in this publication was supported by funding from the King Abdullah University of Science and Technology.
Materials
| Wood part A (12.5×2.5×1.8 cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part B (12.7×10.7×1.8cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part C (11×2.5×1.8cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Screws (4×25 mm) | Screwfix | 79939 | |
| Harmon Face Values 3oz mini sprayer | Bed, Bath and Beyond | ||
| stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) | Metals Depot Int. Inc. | 2192 | |
| Pencil Classic HB | Papermate | 58592 | |
| Paper clip | Office Depot | 221720 | |
| speaker cable | RCA Inc. | AH1650SN | |
| Energizer 9V alkaline battery | Energizer Holdings Inc. | EN22 | |
| Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4kg/cm output torque @ 6V | Hitech RCD USA Inc. | 32082S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 28 cm plastic cable ties | General Electric Inc. | 50725 | |
| Duct tape | 3M Inc. | 3939 | |
| littleBits w1 wire | littleBits Inc. | w1 wire | |
| littleBits p1 power | littleBits Inc. | p1 power | |
| littleBits i2 toggle switch | littleBits Inc. | i2 toggle switch | |
| littleBits 011 servo | littleBits Inc. | 011 servo | |
| 20 cm plastic covered wire twist ties | Four Star Plastics | 71TIE8000 | |
| Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma-Aldrich Inc. | 224758 | |
| Ammonium cerium(IV) nitrate | Sigma-Aldrich Inc. | 22249 | |
| Isofluorane | Baxter Healthcare | 1001936060 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | PBS1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2854 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich Inc. | T0886 | |
| Water | Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ) | ||
| Female nude (outbred) mice | Jackson Laboratories | 1929 | age 5 – 6 weeks |
| Strain C57BL/6J | |||
| NU/J male mice at | Jackson Laboratories | 2019 | age 6 – 8 weeks |
| IVIS 200 bioluminescence reader | Caliper Live Science | ||
| Live Image 4.2 software | Perkin-Elmer | 128165 | |
| Microscope slides | ThermoScientific | 4951PLUS4 |
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