Un modelo murino de Grupo B<em> Streptococcus</em> Colonización vaginal

Summary

El objetivo de este protocolo es imitar grupo humano Streptococcus B (GBS) la colonización vaginal en un modelo murino. Este método se puede utilizar para investigar respuestas inmunes del huésped y factores bacterianos que contribuyen a la persistencia vaginal GBS, así como para poner a prueba estrategias terapéuticas.

Abstract

Streptococcus agalactiae (Streptococcus del grupo B, GBS), es un Gram-positivo, colonizador asintomática del tracto gastrointestinal humano y el tracto vaginal de 10 a 30% de los adultos. En individuos inmunocomprometidos, incluyendo los recién nacidos, mujeres embarazadas y ancianos, GBS puede cambiar a un patógeno invasivo que causa la sepsis, artritis, neumonía y meningitis. Debido a que el GBS es un patógeno bacteriano líder de los recién nacidos, la profilaxis actual se compone de detección final de la gestación para la colonización vaginal por EGB y el tratamiento con antibióticos periparto posterior de las madres GBS-positivas. carga vaginal abundante GBS es un factor de riesgo tanto para la enfermedad neonatal y la colonización. Por desgracia, poco se sabe acerca del anfitrión y los factores bacterianos que favorecer o permitir la colonización por GBS vaginal. Este protocolo describe una técnica para establecer persistente colonización vaginal GBS utilizando un β-estradiol solo pre-tratamiento y toma de muestras diariamente para determinar loa bacterianare. Aún más detalles métodos para administrar terapias o reactivos de interés adicionales y para recoger el líquido de lavado vaginal y los tejidos del tracto reproductivo. Este modelo de ratón será favorecer la comprensión de la interacción GBS-host dentro del ambiente vaginal, lo que conducirá a posibles dianas terapéuticas para controlar la colonización vaginal de la madre durante el embarazo y para prevenir la transmisión al recién nacido vulnerable. También será de interés para aumentar nuestra comprensión de las interacciones generales bacteriana en host en el tracto vaginal femenino.

Introduction

Streptococcus agalactiae, Streptococcus del grupo B (GBS), es una bacteria encapsulada, Gram-positiva que con frecuencia se aísla de los intestinos y el tracto genitourinario de adultos sanos. En la década de 1970, GBS surgió como el agente principal de mortalidad neonatal infecciosa, con más de 7.000 casos de la enfermedad neonatal por año ^1. La aparición temprana de la enfermedad por EGB (EOD) se produce en las primeras horas o días de vida, surge como neumonía o dificultad respiratoria, y con frecuencia se desarrolla en la sepsis, mientras que la enfermedad de aparición tardía (LOD) sobreviene después de varios meses y se presenta con bacteriemia, que con frecuencia avanza a la meningitis ^2. A partir de 2002, los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades recomiendan el cribado universal de la colonización vaginal por EGB en el final de la gestación y la profilaxis antibiótica intraparto (IAP) para las madres GBS-positivas ^1. A pesar de la reducción de la enfermedad de aparición temprana a aproximadamente 1.000 casos en los Estados Unidos anualmente debido a IAP,GBS sigue siendo la principal causa de sepsis neonatal de aparición temprana, y la aparición de inicio tardío no se ve afectada ^1. Ya sea en el útero, durante el parto, o incluso en los casos de aparición tardía, la exposición neonatal a GBS requiere la supervivencia, transversal a través de una serie de entornos y barreras de acogida, la evasión inmune y, en el caso de meningitis, cruce de la sangre altamente regulado ² barrera del cerebro. Aguas arriba de estas interacciones virulentas en el recién nacido es la colonización inicial del tracto vaginal maternal. Materna GBS las tasas de colonización vaginal varían de 8-18% en los países desarrollados y en desarrollo, con una tasa promedio estimado del 12,7% ^3,4. GBS colonización del tracto vaginal durante el embarazo puede ser constante, intermitente, o de naturaleza transitoria entre las mujeres individuales ^5. Curiosamente, a la edad materna> 36 años se asocia con la colonización persistente ^6. Numerosos factores de riesgo biológicos y socio-económico para la colonización vaginal por EGBhan sido identificados. Los factores biológicos incluyen la colonización gastrointestinal GBS y la ausencia de Lactobacillus en el intestino. Sin embargo, el origen étnico, la obesidad, la higiene, y la actividad sexual también se han asociado con EGB ⁷ vaginal.

Aunque conocidos por causar infecciones neonatales, GBS también causa una variedad de infecciones maternas ambos periparto y posparto. GBS carro se incrementa en mujeres que se presentan con vaginitis ⁸ y, en algunos casos, incluso puede ser la entidad de la enfermedad ^9. Además, GBS ascensión del tracto reproductivo durante el embarazo puede resultar en una infección intra-amniótica o corioamnionitis ^10. Por otra parte, en un máximo de 3,5% de los embarazos, GBS difunde a la vejiga urinaria para causar una infección del tracto urinario o la bacteriuria asintomática ^11. bacteriuria por GBS durante el embarazo se asocia con un mayor riesgo de fiebre intraparto, corioamnionitis, parto prematuro y premature rotura de las membranas ^12. En su conjunto, la presencia de GBS dentro del tracto vaginal está vinculada a las infecciones de múltiples tejidos del huésped, y la capacidad de eliminar GBS de este nicho es imprescindible tanto para la salud materna y neonatal.

Hasta hace poco, la mayoría del trabajo de examinar las interacciones de GBS con el tracto cervicovaginal se limita a los modelos celulares in vitro ^13-15. Estos experimentos in vitro han revelado factores bacterianos que son importantes para la adhesión, incluyendo proteínas de superficie Tal pili y rico en serina repite ^17,18, así como los sistemas de regulación de dos componentes ^15,19 y la respuesta transcripcional global del epitelio vaginal para GBS ^19. Sin embargo, para dilucidar plenamente las interacciones huésped-microorganismo en el tracto vaginal, un modelo animal robusto es necesario. Los primeros trabajos demostraron que GBS se puede recuperar a partir del tracto vaginal de ratones inoculados ^20,21 y ratas <sup> 22 en ambas condiciones embarazadas y no embarazadas. En 2005, a corto plazo la colonización vaginal por EGB se modeló en ratones para examinar la eficacia de una enzima del fago lítico realizar un tratamiento vaginal durante un período de 24 horas ^23. Varios años más tarde, un modelo de ratón de GBS colonización vaginal de larga duración fue desarrollado para estudiar anfitrionas bacterianas y factores que regulan GBS persistencia. Este modelo ha identificado numerosos factores que contribuyen a la colonización por GBS, incluyendo apéndices superficiales ^17,18 y sistemas de dos componentes de GBS ^19,24. Este modelo ha contribuido a la identificación de los mecanismos de respuesta de acogida ^19,25 y fue utilizado para probar varias estrategias terapéuticas, incluyendo péptidos inmunomoduladores ²⁶ y ²⁷ probióticos. Este protocolo da la orientación necesaria para inocular GBS en el tracto vaginal del ratón y posteriormente realizar un seguimiento de la colonización y recoger muestras para análisis posteriores.

Protocol

Todos los animales de trabajo fue aprobado por la Oficina de Cuidado de Animales de Laboratorio de la Universidad Estatal de San Diego y lleva a cabo bajo las normas veterinarias aceptados. Los ratones hembra, edad 8 – 16 semanas, se utilizaron para el desarrollo de este método. 1. Preparación y la inyección intraperitoneal de β-estradiol Medir β-estradiol (0,5 mg / ratón) en un peso de papel mientras que use el equipo de protección personal (EPP) apropiado. PRECAUCIÓN: β-est…

Representative Results

Durante el desarrollo de este modelo, se hicieron varias observaciones acerca de los factores que afectan a la duración de la colonización vaginal por EGB. Para determinar cómo etapa estral en impactos de inoculación bacteriana GBS persistencia, los ratones se llevaron a cabo en el día de la inoculación a través de líquido de lavado vaginal. La Figura 1 ilustra las cuatro etapas del ciclo estral de ratón, como se determina por mojado de montaje en el líquido de…

Discussion

Para promover el avance de la comprensión de las interacciones con el GBS tanto el anfitrión y otros microbios en el contexto del huésped, se requiere un modelo animal. Este trabajo describe los aspectos técnicos del establecimiento de la colonización vaginal por EGB en ratones. Este protocolo logra> 90% colonización de ratones sin el uso de anestésicos para inocular bacterias o para recoger muestras de frotis, inmunes supresores para permitir la colonización, pre-lavado vaginal, o aditivos para espesar el in…

Materials

Sesame oil	Sigma Aldrich	S3547-250ML
β-Estradiol	Sigma Aldrich	E8875-1G	CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces.
200 μL gel loading pipette tips	USA Scientific	1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs	Puritan	25-801 A 50
CHROMagar StrepB	DRG International	SB282
Todd Hewitt Broth	Hardy Diagnostics	7161C
18 G, 1.5 inch needles	BD	305199
26 G, 0.5 inch needles	BD	305111
10 mL syringes	BD	309604
1 mL syringes	BD	309659
0.45 μm PVDF syringe filters	Whatman	6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X	Corning	21-031-CV