En musmodell av grupp B<em> Streptococcus</em> Vaginal Colonization

Summary

Syftet med detta protokoll är att imitera mänskliga grupp B Streptococcus (GBS) vaginal kolonisation i en musmodell. Denna metod kan användas för att undersöka värdimmunsvar och bakteriella faktorer som bidrar till GBS vaginal uthållighet, såväl som för att testa terapeutiska strategier.

Abstract

Streptococcus agalactiae (grupp B-streptokock, GBS), är en grampositiv, asymtomatisk kolonisatör av den humana mag-tarmkanalen och vaginal-tarmkanalen av 10 – 30% av vuxna. I immun äventyras individer, inklusive nyfödda, gravida kvinnor och äldre, kan GBS byta till en invasiv patogen som orsakar sepsis, artrit, lunginflammation, och hjärnhinneinflammation. Eftersom GBS är en ledande bakteriell patogen av nyfödda, är nuvarande profylax består av sen dräktighet screening för GBS vaginal kolonisation och efterföljande peripartumperioden antibiotikabehandling av GBS-positiva mödrar. Tung GBS vaginalt börda är en riskfaktor för både neonatal sjukdom och kolonisering. Tyvärr lite är känt om värden och bakteriella faktorer som främjar eller tillåter GBS vaginal kolonisering. Detta protokoll beskriver en teknik för upprättande av långlivade GBS vaginal kolonisation användning av en enda β-östradiol förbehandling och daglig provtagning för att bestämma bakteriell load. Det ytterligare detaljer metoder för att administrera ytterligare behandlingar eller reagens av intresse och för att samla vaginal lavage och reproduktionsorganen vävnader. Denna musmodell kommer att främja förståelsen av GBS-värd interaktionen i vaginala miljön, vilket kommer att leda till potentiella terapeutiska mål för att kontrollera moderns vaginala kolonisering under graviditet och för att förhindra överföring till utsatta nyfödda. Det kommer också att vara av intresse att öka vår förståelse av allmänna bakterievärdinteraktioner i den kvinnliga vaginan.

Introduction

Streptococcus agalactiae, grupp B-streptokock (GBS), är en inkapslad, grampositiv bakterie som ofta isoleras från tarmen och urogenital-tarmkanalen hos friska vuxna. På 1970-talet, GBS dykt upp som den ledande agent infektiös neonatal dödlighet, med över 7000 fall av neonatal sjukdom årligen ^1. Tidig debut GBS sjukdom (EOD) förekommer i de första timmarna eller dagarna i livet, uppstår som lunginflammation eller andnöd, och ofta utvecklas till sepsis, medan sen debut sjukdom (LOD) följer efter flera månader och presenterar med bakteriemi, som ofta avancerar till meningit ^2. Från och med 2002, de Centers for Disease Control and Prevention rekommenderar universell rastrering för GBS vaginal kolonisation i sen dräktighet och intrapartal antibiotikaprofylax (IAP) för att GBS-positiva mödrar ^1. Trots minskningen av tidig debut av sjukdomen till cirka 1000 fall i USA varje år på grund av IAPGBS förblir den vanligaste orsaken till tidig debut neonatal sepsis, och sen debut händelse förblir opåverkad ^1. Vare sig i livmodern, under förlossningen, eller ens i sen debut fall neonatal exponering för GBS kräver överlevnad, tvärgående genom ett antal värdmiljöer och barriärer, immun skatteflykt, och, i fallet med meningit, passage av den starkt reglerade blod- hjärnbarriären ^2. Uppströms dessa virulenta interaktioner inom det nyfödda barnet är den första koloniseringen av moderns vaginan. Moderns GBS vaginal kolonisering varierar mellan 8-18% i utvecklade länder och utvecklingsländer, med en beräknad genomsnittlig hastighet av 12,7% ^3,4. GBS kolonisering av vaginan under graviditeten kan vara konstant, intermittent, eller övergående natur bland enskilda kvinnor ^5. Intressant nog är en moderns ålder> 36 år i samband med ihållande kolonisering ^6. Talrika biologiska och socioekonomiska riskfaktorer för GBS vaginal koloniseringhar identifierats. Biologiska faktorer inkluderar gastrointestinala GBS kolonisering och frånvaro av Lactobacillus i tarmen. Emellertid har etnicitet, fetma, hygien, och sexuell aktivitet också förknippats med GBS vaginal vagnen ^7.

Även ökända för att orsaka neonatala infektioner GBS orsakar också en mängd av moderns infektioner både peripartumperioden och postpartum. GBS vagnen ökar hos kvinnor som framlägger med vaginit ⁸ och, i vissa fall kan till och med vara sjukdomen enheten ^9. Dessutom kan GBS uppstigning av fortplantningsorganen under graviditeten leda till inom fostervatten infektion eller korioamnionit ^10. Dessutom i upp till 3,5% av graviditeter, sprider GBS till urinblåsan för att orsaka en urinvägsinfektion eller asymtomatisk bakteriuri ^11. GBS bakteriuri under graviditeten är associerat med en ökad risk för intrapartal feber, korioamnionit, för tidig födsel, och Premature hinnbristning ^12. Sammantaget är närvaron av GBS i vaginan kopplat till infektioner i flera värdvävnader, och förmåga att eliminera GBS från denna nisch är viktigt för både mödrar och nyfödda hälsa.

Tills nyligen var de flesta av arbete undersöker GBS interaktioner med cervicovaginal vägarna begränsas till cell in vitro modeller ^13-15. Dessa in vitro experiment har visat bakteriella faktorer som är viktiga för efterlevnad, inklusive ytproteiner såsom en pili och serin rika upprepningarna ^17,18, samt två-komponent regelsystem ^15,19 och den globala transkriptionssvaret hos vaginala epitel till GBS ^19. Men för att fullt belysa värd-mikrobinteraktioner inom vaginalkanalen, är det nödvändigt med en robust djurmodell. Tidigt arbete visade att GBS kan utvinnas ur vaginan av ympade möss ^20,21 och råttor <sup> 22 i både gravida och icke-gravida förhållanden. År 2005 var kortsiktiga GBS vaginal kolonisation modelleras i möss för att undersöka effekten av en fag lytiskt enzym för att behandla vaginal GBS under en 24 timmarsperiod ^23. Flera år senare, var en långsiktig GBS vaginal kolonisering musmodell utvecklats för att studera värd och bakteriella faktorer som styr GBS uthållighet. Denna modell har identifierat ett antal GBS faktorer som bidrar till kolonisering, inklusive ytan bihang ^17,18 och GBS tvåkomponentsystem ^19,24. Denna modell har bidragit till identifiering av värdsvarsmekanismer ^19,25 och användes för att testa flera terapeutiska strategier, bland annat immunmodulerande peptider ²⁶ och probiotika ^27. Detta protokoll ger nödvändig vägledning för att ympa GBS i musen vaginan och därefter spåra kolonisering och samla in prover för ytterligare analyser.

Protocol

Alla djur arbete godkändes av Office of Lab Animal Care på San Diego State University och genomförs under vedertagna veterinära normer. Honmöss, ålder 8 – 16 veckor, användes för att utveckla denna metod. 1. Upprättande och intraperitoneal injektion av β-östradiol Mät upp β-östradiol (0,5 mg / mus) på väga papper iklädd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE). VARNING: β-estradiol kan absorberas genom huden och slemhinnor. Överföra β-östradiol till en…

Representative Results

Under utvecklingen av denna modell, har flera observationer gjorts avseende faktorer som påverkar varaktigheten av GBS vaginalt kolonisering. För att avgöra hur brunst scenen på ympning effekter GBS bakteriella uthållighet, möss iscensatt på dagen för ympning via vaginalsköljvätska. Figur 1 visar de fyra stegen i musen Östrogencykeln, som bestäms av wet-mount vaginal lavage, en väletablerad metod 29. Mössen delades in i grupper baserat på detta …

Discussion

Att främja utvecklingen av förståelsen av GBS interaktioner med både värden och andra mikrober i samband med värden, är en djurmodell krävs. Detta arbete beskriver de tekniska aspekterna av upprättandet GBS vaginal kolonisering hos möss. Detta protokoll åstadkommer> 90% kolonisering av möss utan användning av bedövningsmedel för att inokulera bakterier eller för att samla pinnprover, immun-suppressants att möjliggöra kolonisering, vaginal förtvätt, eller tillsatser för att förtjocka inokulat. De…

Materials

Sesame oil	Sigma Aldrich	S3547-250ML
β-Estradiol	Sigma Aldrich	E8875-1G	CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces.
200 μL gel loading pipette tips	USA Scientific	1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs	Puritan	25-801 A 50
CHROMagar StrepB	DRG International	SB282
Todd Hewitt Broth	Hardy Diagnostics	7161C
18 G, 1.5 inch needles	BD	305199
26 G, 0.5 inch needles	BD	305111
10 mL syringes	BD	309604
1 mL syringes	BD	309659
0.45 μm PVDF syringe filters	Whatman	6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X	Corning	21-031-CV