En Murine modell av gruppe B<em> Streptococcus</em> Vaginal Colonization

Summary

Hensikten med denne protokollen er å etterligne humant gruppe B Streptococcus (GBS) vaginal kolonisering i en murin modell. Denne fremgangsmåten kan brukes til å undersøke vertsimmunresponser og bakterielle faktorer som bidrar til GBS vaginal utholdenhet, så vel som for å teste terapeutiske strategier.

Abstract

Streptococcus agalactiae (gruppe B Streptococcus, GBS), er en Gram-positiv, asymptomatisk colonizer av den humane mage-tarmkanalen og vaginal skrift av 10 – 30% av voksne. I svekket immunforsvar personer, inkludert nyfødte, gravide og eldre, kan GBS bytte til en invasiv patogen forårsaker sepsis, leddgikt, lungebetennelse og hjernehinnebetennelse. Fordi GBS er en ledende bakteriell patogen av nyfødte, er aktuell profylakse består av sent i svangerskapet screening for GBS vaginal kolonisering og påfølgende peripartum antibiotikabehandling av GBS-positive mødre. Heavy GBS vaginal byrde er en risikofaktor for både neonatal sykdom og kolonisering. Dessverre er lite kjent om verten og bakterielle faktorer som fremmer eller tillater GBS vaginal kolonisering. Denne protokollen beskriver en teknikk for å etablere vedvarende vaginal GBS kolonisering ved hjelp av et enkelt β-østradiol forbehandling og daglig sampling for å bestemme bakterie load. Det videre detaljer metoder for å administrere flere behandlinger eller reagenser av interesse og for å samle vaginal lavage væske og reproduktive veis vev. Denne musen modellen vil fremme forståelsen av GBS-host samhandling innen vaginal miljøet, noe som vil føre til potensielle terapeutiske mål å kontrollere mors vaginal kolonisering under graviditet og for å hindre overføring til den sårbare nyfødte. Det vil også være av interesse å øke vår forståelse av generelle bakterie-vert interaksjoner i den kvinnelige vaginal kanalen.

Introduction

Streptococcus agalactiae, gruppe B Streptococcus (GBS), er en innkapslet, grampositiv bakterie som ofte isoleres fra tarmen og urogenitalsystem hos friske voksne. På 1970-tallet GBS dukket opp som den ledende agent for smittsomme neonatal dødelighet, med over 7000 tilfeller av neonatal sykdom årlig ^1. Tidlig innsettende GBS-sykdom (EOD) oppstår i de første timene eller dagene av livet, oppstår som lungebetennelse eller pustevansker, og ofte utvikler seg til sepsis, mens sent oppstått sykdom (LOD) følger etter flere måneder, og presenterer med bakteriemi, som ofte avanserer til meningitt ^to. Per 2002, Centers for Disease Control and Prevention anbefaler universell screening for GBS vaginal kolonisering i slutten av svangerskapet og intrapartum antibiotikaprofylakse (IAP) for å GBS-positive mødre ^1. Til tross for reduksjon av tidlig debut av sykdommen til ca 1000 tilfeller i USA hvert år på grunn av IAP,GBS er fortsatt den ledende årsak til tidlig debut neonatal sepsis, og sent innsettende forekomst forblir upåvirket ^en. Enten i utero, under fødselen, eller til og med sen debut tilfeller neonatal eksponering for GBS krever overlevelse, tverrgående gjennom en rekke vertsmiljøer og barrierer, immune evasion, og i tilfelle av hjernehinnebetennelse, kryssing av sterkt regulert blod- hjerne barrieren ^to. Upstream av disse virulente interaksjoner i det nyfødte barnet er den første kolonisering av morens vaginal kanalen. Mors GBS vaginal koloniserings priser varierer 8-18% i utviklede og utviklingsland, med en anslått gjennomsnittlig rente på 12,7% ^3,4. GBS kolonisering av vaginal skrift under svangerskapet kan være konstant, intermitterende, eller forbigående blant enkelte kvinner ^5. Interessant er en mors alder> 36 år i forbindelse med vedvarende kolonisering ^6. Mange biologiske og sosioøkonomiske risikofaktorer for GBS vaginal koloniseringDet er identifisert. Biologiske faktorer omfatter gastrointestinalt GBS kolonisering og fravær av Lactobacillus i tarmen. Imidlertid har etnisk, fedme, hygiene, og seksuell aktivitet har også blitt assosiert med GBS vaginal vogn ^7.

Selv beryktet for å forårsake neonatal infeksjoner, GBS fører også en rekke mors infeksjoner både peripartum og postpartum. GBS vogn er økt hos kvinner som opplever vaginitt ⁸ og, i enkelte tilfeller kan til og med være sykdom enhet ^9. I tillegg kan GBS himmelfart skjede under svangerskapet fører til intra-fostervann infeksjon eller korioamnionitt ^10. Videre, i opp til 3,5% av alle svangerskap, GBS formidler til urinblæren til å forårsake en urinveisinfeksjon eller asymptomatisk bakteriuri ^11. GBS bakteriuri under svangerskapet er forbundet med økt risiko for intrapartal feber, korioamnionitt, prematur fødsel, og premature vannavgang ^12. Tatt sammen, er nærværet av GBS innenfor vaginal kanalen koblet til infeksjoner av flere verts vev, og evnen til å eliminere GBS fra denne nisjen er viktig for både mor og neonatal helse.

Inntil nylig var det meste av arbeidet undersøker GBS interaksjoner med cervicovaginal kanalen begrenset til in vitro cellemodeller ^13-15. Disse in vitro forsøk har avdekket bakterielle faktorer som er viktige for etterlevelse, inkludert overflateproteiner slik en pili og serin-rich gjentar ^17,18, samt to-komponent regelverk ^15,19 og den globale transcriptional responsen av vaginal Epitel til GBS ^19. Men for å fullt ut belyse host-mikrobe interaksjoner innenfor skjedekanalen, er en robust dyremodell nødvendig. Tidlig arbeid vist at GBS kan utvinnes fra vaginal skrift av inokulerte mus ^20,21 og rotter <sup> 22 i både gravide og ikke-gravide betingelser. I 2005 ble kortvarig GBS vaginal kolonisering modellert på mus for å undersøke effekten av et fag lytisk enzym for å behandle vaginal GBS over en 24 timers periode ^23. Flere år senere, ble en langsiktig GBS vaginal kolonisering musemodell utviklet for å studere verts og bakterielle faktorer som styrer GBS utholdenhet. Denne modellen har identifisert en rekke GBS faktorer som bidrar til kolonisering, inkludert overflate vedheng ^17,18 og GBS to-komponent systemer ^19,24. Denne modellen har bidratt til identifisering av vertsresponsmekanismer ^19,25 og ble brukt til å teste flere terapeutiske strategier, inkludert immunmodulerende peptider ²⁶ og probiotika ^27. Denne protokollen gir nødvendig veiledning for å vaksinere GBS i musen vaginal kanalen og deretter å spore kolonisering og samle inn prøver for videre analyser.

Protocol

Alle dyr arbeidet ble godkjent av Office of Lab Animal Care i San Diego State University og gjennomført under aksepterte veterinær standarder. Hunnmus, alder 8 – 16 uker, ble anvendt for utvikling av denne fremgangsmåte. 1. Forberedelse og intraperitoneal injeksjon av β-østradiol Mål opp β-østradiol (0,5 mg / mus) på veier papir mens iført egnet personlig verneutstyr (PVU). FORSIKTIG: β-østradiol kan absorberes gjennom huden og slimhinneoverflater. Overfør β-ø…

Representative Results

Under utviklingen av denne modellen, ble flere observasjoner gjort om faktorer som påvirker varigheten av GBS vaginal kolonisering. For å finne ut hvordan estrous scenen på inokulasjon konsekvenser GBS bakteriell utholdenhet, ble musene iscenesatt på dagen for vaksinasjon via vaginal lavage væske. Figur 1 viser de fire faser av mus brunst, bestemt ved hjelp av våt-typen vaginal vaskevæske, en veletablert metode 29. Musene ble delt inn i grupper basert p…

Discussion

For å fremme utvikling av forståelsen av GBS-interaksjoner med både verts og andre mikrober innenfor rammen av verten, er en dyremodell nødvendig. Dette arbeidet beskriver de tekniske aspektene ved å etablere GBS vaginal kolonisering hos mus. Denne protokollen oppnår> 90% koloniseringen av musene uten bruk av bedøvelse for å inokulere bakterier eller for å samle inn penselprøver, immun-undertrykkende midler for å muliggjøre kolonisering, vaginal forvask eller additiver for å fortykke inokulum. Dessuten v…

Materials

Sesame oil	Sigma Aldrich	S3547-250ML
β-Estradiol	Sigma Aldrich	E8875-1G	CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces.
200 μL gel loading pipette tips	USA Scientific	1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs	Puritan	25-801 A 50
CHROMagar StrepB	DRG International	SB282
Todd Hewitt Broth	Hardy Diagnostics	7161C
18 G, 1.5 inch needles	BD	305199
26 G, 0.5 inch needles	BD	305111
10 mL syringes	BD	309604
1 mL syringes	BD	309659
0.45 μm PVDF syringe filters	Whatman	6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X	Corning	21-031-CV