यहाँ हम एक तेजी से और कुशल संपादन जीन मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) के AAVS1 लोकस में RMCE पर आधारित तरीका है कि पहले से वर्णित सिस्टम पर सुधार की रिपोर्ट। इस तकनीक का उपयोग करना, isogenic लाइनों को तेजी से और मज़बूती से उचित तुलनात्मक अध्ययन के लिए उत्पन्न किया जा सकता, hPSCs साथ transgenesis की मध्यस्थता अनुसंधान की सुविधा।
यहाँ तक कि जीन को निशाना प्रौद्योगिकियों CRISPR-Cas9, मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) के आनुवंशिक संशोधन के नेतृत्व में क्रांति के साथ अभी भी समय लगता है। तुलनात्मक अध्ययन है कि सुरक्षित बंदरगाह लोकी में एकीकृत transgenes के साथ पुनः संयोजक लाइनों का उपयोग जो अधिक तेजी से और कम बंद लक्ष्य प्रभाव से ग्रस्त हैं दृष्टिकोण है कि साइट विशेष को निशाना बनाया recombinases, रचनात्मक या FLPe की तरह इस्तेमाल करते हैं, से फायदा हो सकता है। इस तरह के तरीकों का वर्णन किया गया है, हालांकि वे काफी मात जीन सबसे पहलुओं में लक्षित नहीं है। जिंक उंगली न्युक्लिअसिज़ का उपयोग करना, हम पहले से hPSCs कि एक GFP-hygromycin-टी कैसेट व्यक्त होता है की AAVS1 लोकस में एक मास्टर सेल लाइन, heterotypic FRT दृश्यों से घिरे बनाया। यहाँ, हम FLPe recombinase की मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज (RMCE) प्रदर्शन करने के लिए इस लाइन का उपयोग प्रक्रियाओं का वर्णन है। मास्टर गपक्ष लाइन एक RMCE दाता वेक्टर है, जो एक promoterless puromycin प्रतिरोध होता है, और FLPe Recombinase के साथ साथ ट्रांसफ़ेक्ट है। दोनों एक सकारात्मक (puromycin) और नकारात्मक (FIAU) चयन कार्यक्रम का आवेदन यादृच्छिक एकीकरण के बिना RMCE के चयन के लिए होता है। RMCE में 100% दक्षता के साथ 15 डी पूरी तरह से विशेषता pluripotent पॉलीक्लोनल ट्रांसजेनिक लाइनों उत्पन्न करता है। बावजूद हाल ही में AAVS1 लोकस की सीमाओं का वर्णन किया है, सिस्टम में आसानी isogenic सेटिंग्स में hPSC transgenesis के लिए मार्ग प्रशस्त, तुलनात्मक अध्ययन के लिए आवश्यक है, और है कि अन्यथा समारोह विश्लेषण के लाभ / हानि के लिए अर्द्ध उच्च throughput आनुवंशिक स्क्रीन में सक्षम बनाता है अत्यधिक समय लगता हो।
लक्षित जीनोम पुनर्संयोजन अनुसंधान के कई क्षेत्रों में तेजी से प्रगति की है। चूहों में, जीनोम संपादन और स्टेम सेल अनुसंधान के बीच तालमेल जीन समारोह और जीन विनियमन के जटिल तंत्र की एक वृद्धि की समझ के लिए अनुमति दी गई है। इस तरह की प्रगति, मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) के रूप में अच्छी तरह से में होने की उम्मीद है, हालांकि कई वर्षों के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के पहले अलगाव (hESCs), और बाद में मानव प्रेरित बाद से स्टेम कोशिकाओं (hiPSCs), जीन संपादन एक तकनीकी बाधा का गठन किया है । जीनोम इंजीनियरिंग में हाल के अग्रिमों लक्षित न्युक्लिअसिज़-जिंक उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs), प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALEN), या का उपयोग संकुल नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता / CRISPR जुड़े प्रोटीन 9 (CRISPR / Cas9) हमें इन पर काबू पाने के लिए अनुमति दी है कठिनाइयों, पुनर्संयोजन निशाना बनाने के लिए एक कुशल प्रक्रिया 1 – 3।
मीटर में विशिष्ट लोकीouse जीनोम कि Rosa26, Hprt1, या Col1A1 तरह प्रतिकूल प्रभाव के अभाव में स्थिर, विश्वसनीय, और सर्वव्यापी transgene अभिव्यक्ति की अनुमति है, आनुवंशिक अध्ययन के प्रदर्शन में आवश्यक उपकरण बन गए हैं। सुरक्षित बंदरगाह लोकी isogenic संदर्भों में चूहों के विभिन्न लाइनों के बीच तुलनीय विश्लेषण अनुमति देते हैं। यह मानक यादृच्छिक एकीकरण विधियों, जो इन्सर्शनल म्युटाजेनेसिस, खुराक पर निर्भर प्रभाव, या विचित्र transgene अभिव्यक्ति की तरह प्रसिद्ध सीमाओं के साथ जुड़े रहे हैं का उपयोग कर हासिल नहीं किया जा सकता है। जीन संपादन आसानी और सुरक्षित बंदरगाह लोकी में लचीलापन साइट विशेष रचनात्मक या Flippase (FLPe) की तरह निशाना बनाया recombinases, जो विशेष रूप से (loxP या FRT क्रमशः) को पहचान लक्ष्य दृश्यों और समान लक्ष्यों के बीच कुशल पुनर्संयोजन उत्प्रेरित के उपयोग के माध्यम से वृद्धि हुई है। इन विशेषताओं के कारण, recombinase की मध्यस्थता जीन preintegrated सुरक्षित बंदरगाह लोकी में loxP या FRT दृश्यों का उपयोग संपादन माउस ट्रांस में इस्तेमाल एक आम उपकरण हैउत्पत्ति। कैसेट प्रविष्टि या छांटना समान लक्ष्य दृश्यों के बीच मध्यस्थता करने के अलावा, असंगत या loxP FRT साइटों के उपयोग recombinase की मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज (RMCE) 4 के लिए अनुमति देता है।
मानव में, की पहचान करने के लिए सुरक्षित आश्रय स्थलों बाहर किया गया है प्रयास करता है। माउस orthologous HPRT, हानि के समारोह Lesch-Nyhan सिंड्रोम, और ROSA26 के साथ अपने सहयोग के बावजूद hPSCs में लक्षित किया गया है। HPRT तेजी से ईएससी में transgene अभिव्यक्ति चुप्पी और ROSA26 तरह की सूचना मिली थी, में transgene अभिव्यक्ति को बनाए रखने के लिए अपनी क्षमता टर्मिनली विभेदित कोशिकाओं की जांच नहीं की गई थी 5 – 7। CCR5 जीन की एक homozygous अशक्त उत्परिवर्तन अच्छी तरह से मानव में सहन किया जा करने के लिए प्रकट होता है क्योंकि, सुरक्षित बंदरगाह के रूप में अपने मूल्य का आकलन किया गया था। CCR5 लक्षित और ESCs 8,9 सहित विभिन्न मानव कोशिका लाइनों में स्थिर transgene अभिव्यक्ति को बनाए रखने के लिए सूचित किया गया था। तथापि,बाद के लिए लंबी अवधि के दौरान संस्कृति प्रतिरूप स्तर पर साबित हो गया था नहीं, और सर्वव्यापी transgene अभिव्यक्ति तीन रोगाणु परतों की विभेदित संतान में प्रदर्शन नहीं कर रहा था। AAVS1, एडिनो जुड़े वायरस टाइप 2 (एएवी) के प्राकृतिक एकीकरण साइट, परीक्षण किया गया था ट्रांस्जीन को सूचना दी प्रतिरोध की वजह के रूप में अच्छी hESCs, में 10 मुंह बंद। बाद में, कई समूहों AAVS1 ठिकाना इस्तेमाल किया और अविभाजित hPSCs में स्थिर transgene अभिव्यक्ति है, साथ ही में सभी तीन रोगाणु परतों के अपने अलग-अलग संतान वर्णित है, दोनों इन विट्रो और इन विवो 2,8,11,12 में। हाल के परिणाम फिर भी इन निष्कर्षों अति सूक्ष्म अंतर के रूप में AAVS1 ठिकाना undifferentiated hESCs में और hepatocyte संतान 13 में इन विट्रो में चर ट्रांस्जीन निषेध लागू करने के लिए मिला था।
यादृच्छिक एकीकरण दृष्टिकोण और विधियों का उपयोग कर अतिरिक्त स्क्रीनिंग अध्ययन भी कॉपी Geno लगाने के उद्देश्य से एकीकरण निर्धारित करने के लिएhPSCs विस्तार और भेदभाव 14,15 दौरान mic एकीकरण साइटों ट्रांस्जीन मुंह बंद करने के लिए प्रतिरोधी। कुल मिलाकर, अब तक, कोई जीनोमिक साइट पूरी तरह से hPSCs और उनकी संतान में एक सुरक्षित बंदरगाह के रूप में मान्य किया गया है; सर्वव्यापी स्थिर transgene अभिव्यक्ति, hPSCs में भी, लेकिन इन विट्रो और इन विवो में उनकी भेदभाव संततियों में न केवल के लिए एक उपयुक्त स्थल की पहचान, हल किया जाना बना रहता है। सभी का अध्ययन किया लोकी के अलावा और अपनी सीमाओं के बावजूद, AAVS1 रहता सबसे विशेषता है और स्टेम सेल अनुसंधान के क्षेत्र में सबसे अधिक इस्तेमाल किया।
RMCE सफलतापूर्वक इन लोकी 6,7,14,16 में से कुछ में hPSCs में बाहर किया गया है, ज्यादातर Cre recombinase का उपयोग कर, भले ही ऐसे संकेत मिले हैं कि FLPe Cre 17 से अधिक कुशल है कर रहे हैं। इन सभी मामलों में, एक सकारात्मक दवा प्रतिरोध कैसेट पुनः संयोजक कालोनियों के चयन के लिए इस्तेमाल किया गया था। हालांकि सफल, इन प्रक्रियाओं के मानक gene- पर एक तकनीकी अग्रिम का गठन नहीं हैZFNs का उपयोग कर संपादन प्रक्रियाओं, TALENS या CRISPR / Cas9, के रूप में एक भी एंटीबायोटिक चयन प्रक्रिया से बाहर यादृच्छिक एकीकरण शासन और सही ढंग से लक्षित क्लोन की पहचान करने के लिए कॉलोनी स्क्रीनिंग की आवश्यकता नहीं है।
इस प्रक्रिया में, हम तरीकों RMCE hPSCs में AAVS1 लोकस में (preintegrated कैसेट के अंदर) (आने वाली कैसेट के अंदर) के सकारात्मक और नकारात्मक के संयोजन का उपयोग कर चयन है कि पॉलीक्लोनल ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं ± 15 दिनों में साथ प्रदर्शन करने का वर्णन 100% दक्षता और यादृच्छिक एकीकरण की घटनाओं से मुक्त। इसलिए, इस विधि hPSCs में वर्तमान में वर्णित RMCE प्रौद्योगिकियों परे प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है।
सुरक्षित बंदरगाह लोकी में जीन संपादन विधियों hPSCs में transgenesis विकसित करने के लिए एक अनिवार्य उपकरण रहते हैं। हालांकि AAVS1 के सुरक्षित बंदरगाह चरित्र हाल ही में कुछ अनुप्रयोगों 13,18 के लिए पूछताछ की गई है, इस ठिकाना वर्तमान में सबसे अच्छा मानव व्युत्पन्न सेल लाइनों में विशेषता बनी हुई है। hPSCs में अपनी सीमाओं के बारे में जागरूकता विश्वसनीय आंकड़े प्राप्त करने के लिए कर सकते हैं। इसलिए, AAVS1 अभी भी एक उपयोगी साइट gain- और नुकसान के समारोह के अध्ययन या कारक है कि भीतर और निर्धारित आनुवंशिक पृष्ठभूमि के बीच एक isogenic संदर्भ की आवश्यकता के inducible / विधान अभिव्यक्ति के लिए, उदाहरण के लिए, होने की उम्मीद है।
AAVS1 ठिकाना ZFNs, talen या CRISPR / Cas9 1,2,19 का उपयोग कर कई समूहों द्वारा लक्षित किया गया है। ये न्युक्लिअसिज़ काफी एक निर्धारित लोकस में मुताबिक़ पुनर्संयोजन की दक्षता में वृद्धि हुई है। हालांकि, इस प्रक्रिया स्क्रीन करने के लिए और पूरी तरह से सही ढंग से लक्षित क्लोन, यादृच्छिक integ से मुक्त विशेषताएँराशन और pluripotency बनाए रखने और अखंडता जीनोम 3 महीने (अनुकूलित जीन संपादन उपकरण का उपयोग) (चित्रा 3) तक का समय लग सकता है। पिछले दो बंद लक्ष्य nuclease गतिविधि द्वारा उत्पन्न संभव म्यूटेशन की वजह से हो सकता है। RMCE यहां इस्तेमाल किया प्रणाली, हालांकि, एक बार recombinase-विशिष्ट लक्ष्य दृश्यों AAVS1 लोकस में preintegrated रहे हैं, केवल दो सप्ताह में इस उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए एक तेजी से, कुशल, और सुरुचिपूर्ण तरीका प्रदान करता है। सकारात्मक / नकारात्मक चयन और एक उचित चयन कार्यक्रम के उपयोग RMCE द्वारा AAVS1 लोकस में जीन संपादन के सरलीकरण के लिए योगदान मुख्य कारक हैं।
नए ट्रांसजेनिक लाइनों के genotypic लक्षण वर्णन काफी कम है (कोई प्रतिरूप स्क्रीनिंग आवश्यक है), और बंद लक्ष्य nuclease गतिविधि के लिए जुड़े लक्षण वर्णन FRTs के लिए FLPe की विशिष्टता के कारण नगण्य प्रदान की गई है। लक्षण वर्णन भी प्रदर्शन द्वारा दिनचर्या RMCE प्रयोगों में कम किया जा सकतामास्टर सेल लाइन (2A चित्रा) से GFP अभिव्यक्ति का पूरा नुकसान है, क्योंकि पूरा कैसेट विनिमय और यादृच्छिक एकीकरण की कमी पहले से ही पर्याप्त पीसीआर (चित्रा 2 बी) के द्वारा प्रदर्शन किया गया है और दक्षिणी धब्बा 13। सकारात्मक / नकारात्मक चयन का उपयोग भी पिछली रिपोर्टों के साथ मुख्य अंतर का गठन किया। कई समूहों है कि पहले hPSCs में RMCE वर्णित है, या तो AAVS1 या अन्य स्थलों में, केवल एक ही सकारात्मक चयन कदम 7,14,16 कार्यरत हैं। यह न्युक्लिअसिज़ के साथ प्रदर्शन जीन संपादन पर एक बड़ा तकनीकी लाभ का गठन नहीं करता कॉलोनी स्क्रीनिंग समान रूप से आदेश प्रतिरूप स्तर पर सही एकीकरण और यादृच्छिक एकीकरण के अभाव का प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन किया जा रहा है क्योंकि।
कई hESC / IPSC लाइनों में इस RMCE प्रणाली का प्रयोग प्रत्येक स्वतंत्र लाइन के AAVS1 लोकस में वर्णित FRT युक्त कैसेट की preintegration की आवश्यकता है। हालांकि, एक बार उत्पन्न,इसकी तीव्रता और सादगी के लिए यह संभव नहीं तो यह है कि ऊपर उल्लेख किया अनुप्रयोगों के लिए परिभाषित isogenic सेटिंग्स में अर्द्ध उच्च throughput आनुवंशिक स्क्रीन विकसित करने के लिए तकनीकी रूप से बहुत समय लगता होगा बनाता है। इसके अलावा, सभी RMCE वैक्टर PZ AAVS1 जीन को निशाना ZFNs साथ ठिकाना निशाना बनाने के लिए इस्तेमाल किया वेक्टर के भीतर निर्माण कर रहे हैं, लेकिन TALENS या CRISPR / Cas9 भी सूचित किया गया। RMCE वेक्टर के द्वंद्व अत्यधिक साथ या बिना FRT hPSCs में एक निर्धारित ट्रांस्जीन के लिए कई लाइनों उत्पन्न करने के लिए उपयोगी है। उदाहरण के लिए, एक हिट RMCE द्वारा किए गए एक निर्धारित आनुवंशिक स्क्रीन में सफल प्रदर्शन आदर्श परिणामों की पुष्टि करने के लिए कई hPSC लाइनों में परीक्षण किया जा करने की आवश्यकता होगी। कई RMCE-उपयुक्त मास्टर सेल लाइनों के अभाव में, प्रत्यक्ष जीन न्युक्लिअसिज़ का उपयोग कर हिट के लक्षित कर प्रदर्शन किया जा सकता है। RMCE वैक्टर के दोहरे चरित्र की उपयोगिता हमारे समूह 20 से सिद्ध किया गया है। इस अध्ययन में, जीन सुधार में रोगी व्युत्पन्न बाहर किया गया थाFrontotemporal मनोभ्रंश (FTD) IPSCs कि एक उत्परिवर्तन के कारण PROGRANULIN (PGRN) अभिव्यक्ति की कमी सहन। एक कैसेट कि PGRN स्तरों बहाल की AAVS1 लोकस में ZFNs की मध्यस्थता प्रविष्टि द्वारा जीन पूरक, उत्परिवर्तन की उपस्थिति के साथ जुड़े corticogenesis में दोषपूर्ण phenotype सही। इसके अतिरिक्त, एक तुलनीय लाइन गुम्मट hESCs में RMCE द्वारा उत्पन्न बहिर्जात PGRN अभिव्यक्ति के लिए नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा था।
पुनः संयोजक कालोनियों के अभाव में, RMCE दाता वेक्टर के अभिकर्मक दक्षता की जाँच करें। अभिकर्मक 30% करने के लिए बेहतर क्षमता ऊपर संकेत परिणाम निकलेगा। लोअर अभिकर्मक क्षमता पुनर्संयोजन दक्षता में कमी। अंत में, RMCE प्रणाली AAVS1 लोकस में उत्पन्न किया गया है, लेकिन यह किसी भी अन्य ठिकाना लिए लागू है।
The authors have nothing to disclose.
L.O. was funded by IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04, and the Government of Aragon FMI048/08; RB by IWT fellowship SB-121396; M.P. by FWO 1288714N; and R.S. by the Dutch Diabetes Foundation. N.H., J.V., K.C., and Q.C. were supported by IWT fellowships SB-121396, SB-101230, SB-91228, and SB-093228, respectively. Funding to C.M.V. was from FWO G.0667.07, G.0975.11, and KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeers |
CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F7524 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
Matrigel hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder free culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder free culture |
Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
RMCE donors | – | – | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
Agarose | Sigma | A9539 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |