Här rapporterar vi en snabb och effektiv gen redigeringsmetod baserad på RMCE i AAVS1 platsen för mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) som förbättrar tidigare beskrivna system. Med användning av denna teknik kan isogena linjer snabbt och tillförlitligt som genereras för korrekt jämförande studier, underlätta transgenes-medierad forskning med hPSCs.
Även med revolutionen gen inriktning teknik under ledning av crispr-Cas9, genetisk modifiering av mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) är fortfarande tidsödande. Jämförande studier som använder rekombinanta linjer med transgener integrerade i safe harbor loci kan dra nytta av metoder som använder platsspecifika riktade rekombinaser, som Cre eller FLPe, som är snabbare och mindre benägna att off-mål effekter. Sådana metoder har beskrivits, även om de inte är avsevärt bättre än föregående genmålinriktning i de flesta aspekter. Använda zinkfinger nukleaser, tidigare har vi skapat en mästare cellinje i AAVS1 platsen för hPSCs som innehåller en GFP-Hygromycin-tk uttryckande kassetten, flankerad av hetero FRT-sekvenser. Här beskriver vi förfaranden för att utföra FLPe rekombinas-medierad kassettutbyte (RMCE) använder linjen. Befälhavaren cell linje transfekteras med en RMCE donatorvektor, vilken innehåller en promotorlös Puromycin motstånd och med FLPe rekombinas. Tillämpning av både en positiv (Puromycin) och negativa (FIAU) programval leder till valet av RMCE utan slumpmässiga integrationer. RMCE genererar helt karaktäriserade pluripotenta polyklonala transgena linjer i 15 d med 100% effektivitet. Trots den nyligen beskrivna begränsningar av AAVS1 locus, hur lätt systemet banar väg för hPSC genmodifiering i isogena inställningar, är nödvändig för jämförande studier, och möjliggör halv hög genomströmning genetiska skärmar för vinst / förlust av funktionsanalys som annars skulle vara mycket tidskrävande.
Riktade genom rekombination har underlättat snabba framsteg inom många forskningsområden. Hos möss har samverkan mellan genomet redigering och stamcellsforskning tillåts för en ökad förståelse av den komplexa mekanismen av geners funktion och genreglering. Sådana framsteg förväntas i humana pluripotenta stamceller (hPSCs) liksom, även om många år sedan den första isoleringen av humana embryonala stamceller (hESCs), och senare mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), gen redigering har utgjort en teknisk hinder . Senaste framstegen inom genomet teknik med hjälp av riktade nukleaser-zinkfinger nukleaser (ZFNs), transkriptionsaktivator liknande effektor nukleaser (talen), eller Clustered regelbundet mellanrum kort palindromiska upprepningar / crispr-associerat protein 9 (crispr / Cas9) har tillåtit oss att övervinna dessa svårigheter, vilket gör riktade rekombination en effektiv process 1-3.
Specifika loci i mouse genomet som tillåter stabil, pålitlig, och allestädes närvarande transgen expression i frånvaro av negativa effekter som ROSA26, Hprt1 eller Col1A1 har blivit viktiga verktyg i utförandet av genetiska studier. Safe harbor loci tillåter jämförbara analys mellan olika linjer av möss i isogena sammanhang. Detta kan inte åstadkommas med hjälp av standardmetoder slumpmässig integration, som är förknippade med välkända begränsningar som insättningsmutagenes, dosberoende effekter, eller brokiga transgen expression. Gene redigering lätthet och flexibilitet i safe harbor loci ökas genom användning av platsspecifika riktade rekombinaser som Cre eller Flippase (FLPe), som specifikt känner igen målsekvenser (loxP eller FRT, respektive) och katalyserar effektiv rekombination mellan identiska mål. På grund av dessa egenskaper är rekombinas-medierad gen redigering med hjälp av loxP eller FRT-sekvenser i förintegrerade safe harbor loci ett gemensamt verktyg som används i mus transuppkomst. Förutom kassett insättning eller excision förmedlad mellan identiska målsekvenser, användning av inkompatibla loxP eller FRT-ställen möjliggör rekombinas-medierad kassettutbyte (RMCE) 4.
I human har försök att identifiera säkra harbor loci har utförts. Musen ortologa HPRT, trots dess samband med förlust av funktion Lesch-Nyhan syndrom, och ROSA26 har varit inriktat på hPSCs. HPRT rapporterades snabbt tysta transgenexpression i ESC och som ROSA26, dess förmåga att upprätthålla transgenexpression i terminalt differentierade celler undersöktes inte 5-7. Eftersom en homozygot nollmutation av CCR5-genen verkar vara väl tolererad hos människa, var dess värde som trygg hamn bedömas. CCR5 riktades och rapporteras för att upprätthålla en stabil transgen uttryck i olika humana cellinjer, inklusive ESC 8,9. Dock,den senare inte visat på klonnivå under långtidsodling, och allestädes närvarande transgen uttryck inte visat i differentierad avkomma av de tre bakterieskikten. AAVS1 den naturliga platsen för adenoassocierat virus typ 2 (AAV) integration, testades i hESCs liksom, på grund av rapporterade resistens mot transgen tysta 10. Senare, många grupper använde AAVS1 lokuset och beskrivs stabil transgen expression i odifferentierade hPSCs, såväl som i sin differentierade avkomman av alla tre groddblad, både in vitro och in vivo 2,8,11,12. De senaste resultaten ändå nyansera dessa fynd, eftersom AAVS1 locus befanns utöva variabel transgen hämning in vitro i odifferentierade hESCs och i hepatocyte avkomma 13.
Ytterligare screeningstudier med slumpmässiga metoder och integrationsmetoder för att bestämma enda exemplar integration syftar till att hitta genomic integrationsställen som är resistenta mot transgen tystande under hPSCs expansion och differentiering 14,15. Totalt hittills ingen iska webbplats har helt validerats som en trygg hamn i hPSCs och deras avkomma; identifiering av en lämplig plats för ubiquitous stabil transgenexpression, inte bara i hPSCs utan också i deras differentierade avkommor in vitro och in vivo, återstår att lösa. Bland alla de studerade loci och trots sina begränsningar fortfarande AAVS1 bäst karaktäriserade och mest använda inom stamcellsforskningen.
RMCE har framgångsrikt genomförts i hPSCs i vissa av dessa loci 6,7,14,16, använder mest Cre rekombinas, även om det finns indikationer på att FLPe är mer effektiv än Cre 17. I alla dessa fall har en positiv läkemedelsresistens kassett som används för selektion av rekombinanta kolonier. Även framgångsrika, dessa förfaranden inte utgör ett tekniskt framsteg över standard gene-redigeringsförfaranden använder ZFNs, Talens eller crispr / Cas9, som en enda antibiotikum urvalsförfarande utesluter inte slumpmässiga integrationer och kräver koloni screening för att identifiera korrekt målinriktade kloner.
I detta förfarande, beskriver vi metoder för att utföra RMCE i hPSCs i AAVS1 locus med hjälp av en kombination av positiv (inom den inkommande kassett) och negativa (inom förintegrerade kassett) val som möjliggör generering av polyklonala transgena linjer i ± 15 dagar med 100% effektivitet och fri från slumpmässiga integrationshändelser. Därför representerar denna metod framsteg bortom närvarande beskrivna RMCE teknik i hPSCs.
Gene redigeringsmetoder i safe harbor loci förblir ett viktigt verktyg för att utveckla genmodifiering i hPSCs. Även safe harbor karaktär AAVS1 har nyligen ifrågasatts för vissa tillämpningar 13,18, förblir detta lokus för närvarande bäst karakteriseras i cellinjer humant ursprung. Medvetenhet om dess begränsningar i hPSCs kan bidra till att få tillförlitliga uppgifter. Därför AAVS1 fortfarande förväntas vara en användbar webbplats, exempelvis för GAIN- och förlust av funktionsstudier eller inducerbara / konstitutivt uttryck av faktorer som kräver en isogen sammanhang inom och mellan bestämda genetiska bakgrunder.
Den AAVS1 locus har varit föremål för många grupper som använder ZFNs, Talen eller crispr / Cas9 1,2,19. Dessa nukleaser avsevärt öka effektiviteten av homolog rekombination i en bestämd lokus. Men för att processen skärmen och fullständigt karaktärisera korrekt riktade kloner, fria från slumpmässig integranson och bibehålla pluripotens och genom integritet kan ta upp till 3 månader (med optimerade genen redigeringsverktyg) (Figur 3). De sista två kan orsakas av möjliga mutationer som genereras av off-target nukleasaktivitet. Den RMCE system som används här, men erbjuder en snabb, effektiv och elegant metod för att uppnå detta mål på bara två veckor, en gång rekombinas specifika målsekvenser förintegrerade i AAVS1 locus. Användning av positiv / negativ selektion och ett lämpligt urval program är de viktigaste faktorerna som bidrar till förenkling av genen redigering i AAVS1 locus av RMCE.
Genotypisk karakterisering av de nya transgena linjerna har minskat avsevärt (ingen klon screening är nödvändig), och karakterisering i samband med off-target nukleasaktivitet görs onödigt på grund av specificitet FLPe för FRTS. Karakteriseringen kan också reduceras i rutin RMCE experiment genom att visa dentotal förlust av GFP uttryck från master cellinje (Figur 2A), eftersom hela kassett utbyte och brist på slumpmässig integration har redan bevisats tillräckligt av PCR (figur 2B) och Southern blot 13. Användningen av positiv / negativ selektion utgör också den huvudsakliga skillnaden jämfört med tidigare rapporter. Flera grupper som tidigare beskrivna RMCE i hPSCs, antingen i AAVS1 eller andra loci, användes endast en enda positiv selektionssteg 7,14,16. Detta utgör inte en stor teknisk fördel över gen redigering utförs med nukleaser, eftersom koloni screening måste lika utföras för att visa korrekt integrering och frånvaro av slumpmässig integration på klonnivå.
Användning av denna RMCE system flera hESC / IPSC linjer kräver preintegration av den beskrivna FRT-innehållande kassett i AAVS1 platsen för varje självständig. Men när genererade,dess snabbhet och enkelhet gör det möjligt att utveckla halv hög genomströmning genetiska skärmar i definierade isogena inställningar för program som nämns ovan som annars skulle vara tekniskt mycket tidskrävande. Dessutom är alla RMCE vektor konstrueras inom PZ AAVS1 genen inriktning vektor som används för att rikta locus med ZFNs, men Talens eller crispr / Cas9 rapporterades också. Den RMCE vektor dualitet är mycket användbar för att generera flera rader för en bestämd transgen i hPSCs med eller utan FRT. Till exempel, en träff visade framgångsrik i en bestämd genetisk skärm utförs av RMCE skulle helst måste testas i flera hPSC linjer för att bekräfta resultaten. I avsaknad av flera RMCE-lämplig mästare cellinjer, kan direkt genmålinriktning av träffen med hjälp av nukleaser utföras. Nyttan av den dubbla karaktär RMCE vektor har bevisats av vår grupp 20. I denna studie gen korrigering utförs i patient härrörFrontotemporal demens (FTD) iPSCs som bär en mutation som orsakar PROGRANULIN (PGRN) uttryck brist. Gen komplemente genom ZFNs-medierade insättning i AAVS1 lokuset av en kassett som återställde PGRN nivåer, korrigeras den felaktiga fenotyp i corticogenesis associerad med närvaron av mutationen. Dessutom var en jämförbar linje genereras av RMCE i WT hESCs att användas som kontroll för exogen PGRN uttryck.
I frånvaro av rekombinanta kolonier, ta transfektionseffektiviteten av RMCE donatorvektor. Transfektionseffektivitet överlägsna 30% ger de resultat som anges ovan. Lägre transfektionseffektivitet minskar rekombinationseffektivitet. Slutligen har RMCE systemet genererats i AAVS1 locus, men det är tillämpliga på varje annan locus.
The authors have nothing to disclose.
L.O. was funded by IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04, and the Government of Aragon FMI048/08; RB by IWT fellowship SB-121396; M.P. by FWO 1288714N; and R.S. by the Dutch Diabetes Foundation. N.H., J.V., K.C., and Q.C. were supported by IWT fellowships SB-121396, SB-101230, SB-91228, and SB-093228, respectively. Funding to C.M.V. was from FWO G.0667.07, G.0975.11, and KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeers |
CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F7524 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
Matrigel hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder free culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder free culture |
Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
RMCE donors | – | – | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
Agarose | Sigma | A9539 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |