Abstract
Transmissionselektronmikroskop (TEM) ger information om den cellulära organisationen och ultra. Men TEM-analys av sällsynta cellpopulationer, särskilt celler i suspension, såsom hematopoetiska stamceller (HSC: er), är fortfarande begränsad på grund av kravet på ett högt cellantal under provberedning. Det finns några cytospin eller monolager metoder för TEM-analys från knappa prover, men dessa metoder misslyckas med att få betydande kvantitativa data från det begränsade antalet celler. Här är ett alternativ och ny metod för provberedning i TEM studier som beskrivs för sällsynta cellpopulationer som möjliggör kvantitativ analys.
En relativt låg mobilnummer, det vill säga 10.000 HSCs var framgångsrikt använts för TEM-analys jämfört med miljontals celler som normalt används för TEM studier. I synnerhet var Evans blå färgning utförs efter paraformaldehyd-glutaraldehyd (PFA-GA) fixering för att visualisera den lilla cell pellåt, vilket underlättade ingjutning i agaros. Kluster av många celler observerades i ultratunna sektioner. Cellerna hade en väl bevarad morfologi, och de ultra strukturella detaljer hos de Golgi komplexa och flera mitokondrier var synliga. Denna effektiva, lätt och reproducerbar protokoll tillåter provberedning från en låg mobilnummer och kan användas för kvalitativ och kvantitativ TEM-analys på sällsynta cellpopulationer från begränsade biologiska prover.
Introduction
Ultra-strukturella och sub-organell uppgifter om celler har huvudsakligen avslöjats av transmissionselektronmikroskop (TEM) undersökningar från vävnader eller cellpellets 1,2. Fasta bitar av vävnader kan lätt utnyttjas för elektronmikroskopiska studier. Men analyser TEM 1,3 på celler i suspension fortsatt utmanande och kräver höga cellantal, dvs miljontals celler. På grund av detta, ultra-strukturella analyser av sällsynta cellpopulationer i suspension, t ex hematopoetiska stamceller (HSCs), är inte lätta att bedömas. Flera försök för TEM-analys från knappa prover med cytospin eller monolager metoder misslyckas med att få betydande kvantitativa data från det begränsade antalet celler. Således, kravet på en hög cellnummer begränsar användningen av detta kraftfulla verktyg för att förstå de subcellulära ultra uppgifter om sällsynta cellpopulationer.
En viktig begränsning för TEM studier med ett begränsat antal cellsi suspension är lokaliseringen av cellerna för bearbetning och därmed TEM studier från begränsade celler med speciellt små storlekar fortsatt utmanande. Flera alternativa tillvägagångssätt har antagits för att motverka denna begränsning: BSA / bisakrylamid (BSA-BA) medierad polymerisation av cellsuspensionen, färgning av celler med ett färgämne för att göra dem synliga på en tunn film stöd inklusive täck, och TEM-analyser från cytospinberedningar 4-6. Emellertid var mycket begränsad framgång uppnåtts, eftersom mycket få celler återfanns i de avsnitt efter ultra-snittning. Den största utmaningen att identifiera glesa celler kvarstår på grund av cellmonoskiktet fortfarande mestadels osynlig i den stelnade gelén för sektionering. Dessutom kan cytospin framställning av celler ändra deras cellulära organisationen på grund av cellspridning och bräckligheten i cellstrukturen. Därför är dessa inneboende nackdelar motiverar en ny metod för att utföra TEM studier av sällsynta cellpopulationer med merkonsistens. För att övervinna detta problem har vi beskrivit en ny och alternativ provberedning metod för TEM studier från sällsynta cellpopulationer 7.
Här rapporterar vi en effektiv provberedning protokoll för att utföra TEM från knappa biologiska prover med konsekventa kvalitativa och kvantitativa resultat. Evans blue färgning utfördes efter fixering för att lokalisera en liten cellpellet från lågt antal celler, det vill säga, 10000 benmärgs hematopoietiska stam- och stamfaderceller som annars skulle ha förblivit osynliga, och pelleten bäddas in i agaros före dehydrering och harts inbäddning processer. Denna metod kluster cellerna tillsammans och möjliggör effektiv analys av ultrastruktur och subcellulär organisation av hematopoietiska stamceller (identifierade som Lin - Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 -; HSC), en sällsynt från 0,2 till 0,5% cellpopulationen i benmärgen. Denna experimentella proprotokoll kan vara bra att göra ultrastrukturstudier och erhålla kvantitativa resultat på många sällsynta men mycket viktiga populationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer godkändes av Institutional Animal kommittén vid Cincinnati barns Research Foundation. För denna studie hematopoetiska stamceller isolerade från benmärgen hos C57Bl / 6 inavlade möss åldern 2 - 4 månader. Cellsortering med hjälp av FACS efter färgning av BM med olika yta beslutsfattare inklusive Lineage, c-Kit, Sca-1, Flt3 och CD34 som används för rening av HSC baserat på Lin- Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 - grind strategi som standard protokoll som beskrivits tidigare åtta.
VARNING: Flera mycket giftiga kemikalier används under detta förfarande. Dessa är giftiga vid inandning och hudkontakt. Vänligen bära handskar och skyddskläder. Arbeta i dragskåp när du arbetar med dessa kemikalier.
1. Celler, Fixering, Färgning och Pre-inbäddning
- Sortera 10.000 hematopoetiska stamceller (med Lin - Sca-1
- Spinn ner sorterade HSCs vid 1000 xg under 10 min i en 1,5 ml mikrocentrifugrör med hjälp av en centrifug med utsvängbara hinkar. Avlägsna mediet genom försiktig uppsugning och lämna 200 | il medium i rören vid varje steg. I detta skede, cellpelleten förblir osynlig i röret.
- Fixera cellerna genom att tillsätta 0,2 ml av 2x fixativ lösning vid rumstemperatur (RT) under 1 timme 1,9.
- Gör fixeringslösning färska före användning. Vid 1x, lösningen består av 3% paraformaldehyd och 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M kakodylatbuffert.
- Centrifugera cellerna vid 1000 xg under 10 min vid 30 ° C med användning av en centrifug med swing-out hinkar.
- Tvätta cellerna med 600 | il av 0,1 M kakodylatbuffertanvändning av centrifugering och lämnar 200 | j, l buffert i röret efter centrifugering.
- Färga de fixerade cellerna genom tillsats av 200 pl av 2 mg / ml lösning av Evans Blue i kakodylatbuffert och inkubera i 20 min vid RT. Cellerna färgas blå.
- Tvätta cellerna 3 gånger med 600 | il av 0,1 M kakodylatbuffert med användning av centrifugering och lämnar 200 | j, l buffert i röret varje gång.
- Återsuspendera cellerna i 200 pl buffert och överför cellsuspensionen till en 0,5 ml rör. Centrifugera vid 1000 xg under 10 min med användning av en bordscentrifug. Ta bort buffert försiktigt utan att störa nu synliga liten cellpelleten, och lämnar 50 pl buffert i röret.
- Tillsätt 200 mg lågsmältande agaros till 5 ml av 0,1 M kakodylatbuffert i 15 ml rör för en 4% agaros-lösning. Smälta agarosen genom att överföra röret till kokande vatten i en 100 ml glasflaska och hålla ljummet tills de användes.
- Tillsätt 200 pl av 4% lågsmältande agaros upplöst i 0,1 M cacodylaTE-buffert till cellsuspensionen i 0,5 ml rör och omedelbart centrifugera vid 1000 xg under 10 min vid 30 ° C med användning av en bordscentrifug.
- Efter att ha bekräftat att celler pelleterades vid botten av 0,5 ml rör in i den halvfasta agaros efter centrifugering, omedelbart överföra röret till 4 ° C eller is under 20 min för att stelna agarosen. Detta steg är ett mycket kritiskt, eftersom en liten synlig cellpellet i detta steg resulterar i en god kluster av celler under elektronmikroskop.
- Försiktigt överföra den stelnade agarosen innehåller cellpelleten från röret till en 35 mm plast petriskål med buffert med hjälp av en 27 G nål 3,10.
- Trimma de stelnade agarosen innehållande cellpelleten i ett stycke av omkring 1 - 2 mm med en skalpell. Överföra agarosen bit innehöll cellpelleten i ett annat 1,5 ml rör.
- Tvätta 2 - 3 gånger med 600 pl 0,1 M kakodylatbuffert genom att lägga till och ta bort buffert med hjälp av pipett utan centrifugering. Använda denna agaros bit innehöll cellpelleten för nästa steg. I detta steg, kan provet förvaras vid 4 ° C över natten innan du flyttar till nästa steg.
2. Osmification, Uttorkning, inbäddning
- Ta bort kakodylatbuffert från 1,5 ml rör med cellpelleten innehållande agaros med hjälp av en pipett. Tillsätt 1,0 ml av 1% osmiumtetraoxid (OSO4) -lösning i ett dragskåp, och inkubera i 1 timme vid 4 ° C.
- Tvätta tre gånger med 600 | il av 0,1 M kakodylatbuffert och överföra provet till en 20 ml glasskintillationsflaska med ett lock.
- Process provet för uttorkning, infiltration och bädda in harts (t.ex. LX-112) med seriella förändringar av följande lösningar i en 6-brunnsplatta. Flytta cellpellet agaros stycke med pincett.
- Sänka ned provet i 25% etanol vid RT under 15 min.
- Sänka ned provet i 50% etanol vid RT under 15 min.
- Sänk provet i 75%etanol vid RT under 15 min.
- Sänka ned provet i 95% etanol vid RT under 15 min.
- Sänka ned provet i 100% etanol vid RT i 15 min, två gånger.
- Sänka ned provet i etanol: harts (3: 1) vid RT under 30 min.
- Sänka ned provet i etanol: harts (1: 1) vid RT under 30 min.
- Sänka ned provet i etanol: harts (1: 3) vid rumstemperatur under 30 min.
- Sänk provet i rent harts vid RT i 60 minuter, två gånger.
- Överför provet till botten av pyramiden spets formad gummi mögel med pincett försiktigt och tillsätt mer ren harts ovanpå provet att fylla formen. Inkubera provet vid 60 ° C under 72 h under harts polymerisation.
- Ta det polymeriserade hartset pyramid från formarna genom att vrida gummi mögel. En liten svart kluster av celler bör kunna synas i det polymeriserade harts pyramid, såsom beskrivits tidigare 7. Fäst polymeriserade harts pyramiden på monteringscylindern med hjälp av cyanoakrylat.
- Trimma pyramidblock med ett rakblad och en diamantkniv efter montering av blocket på en ultra-mikrotom. Göra en kort brett trapetsform med topp- och botten av blocket parallellt med varandra, och med jämnt vinklade sidor. Denna form av pyramiden hjälper för seriell sektionering.
- Vidare, trimma blocket runt cellpelleten med diamantkniv och ta bort plastsektioner kring cellpelleten agaros bit.
- Klipp 1 pm sektioner med hjälp av en ultra-mikrotom. Flytta avsnitten från vatten båt 1 pm till en glasskiva med hjälp av en ögonfrans verktyg och en metallslinga verktyg som tidigare rapporterats 7. Överför avsnitt om diabilder och överförings diabilder till värmeplattan (37 ° C) för torkning.
- Tillsätt en droppe av toluidinblått lösning på de sektioner med hjälp av en spruta försedd med 0,22 | im filter och inkubera i 3 min. Skölj objektglasen med destillerat vatten och let avsnitten torka. Kontrollera med ett ljusmikroskop för att identifiera positionen av cellerna.
- Skär ultratunna sektioner (70-100 nm) med en diamantkniv. Flytta 2 - 3 avsnitt om 200-mesh nät från vattnet båten till ett glas petriskål med hjälp av en ögonfrans verktyg.
- Överföra glaset petriskål med galler med sektioner till en varm platta vid 30 ° C för att torka sektioner under 30 minuter.
- Fläcka gallren med droppar 1% uranylacetat vid RT under 10 min och skölj sedan i destillerat vatten 6 - 8 gånger. Fläcken med Reynolds blycitrat, vid RT under 5 min och skölj i destillerat vatten 6 - 8 gånger. Överföra glaset petriskål med gallren till en varm platta vid 37 ° C för att torka sektioner.
- Analysera sektioner med ett elektronmikroskop, vid 80 kV 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En effektiv och konsekvent protokoll för provberedning för att utföra TEM-analys från ett litet antal celler finns beskriven. Efter fixering färgning med Evans blue och överföring av cellerna till ett 0,5 ml mikrocentrifugrör hjälpte visualisera den lilla cellpelleten 7. Osmification med osmiumtetraoxid i agaros ledde till en lätt detektering av mörka cellpelleten under uttorkning och inbäddning.
Semi-tunna sektioner från block som innehåller en liten cellpellet bekräftade ett kluster av många celler tillsammans (Figur 1A och 1B). Ultratunna sektioner skars från cell klustrade område och analyseras under elektronmikroskopi (Figur 1C). Morfologin och ultrastrukturen av dessa celler var väl konserverade (figur 1D). Den elektronmikroskopbild av individuell cell visade höga detaljer om den intracelluläraultra-strukturer (figur 1E). Dessutom hög förstoring (50,000X) bilder visade en välbevarad struktur och integritet subcellulära organeller, såsom mitokondrier (figur 1F).
Figur 1: Bildanalys under lätt och elektronmikroskop. (A) låg förstoring bild av en representativ fält av en toluidinblått färgade delen av en fim tjocklek under ljusmikroskop. (B) Ljusmikroskopbild som visar den intakta morfologi av celler i kluster efter toluidinblått färgning av ett pm tjocklek avsnitt. (C) En översikt området för cellkluster observeras under elektronmikroskop efter färgning med uranylacetat och blycitrat. (D) En enda LT-HSC enligt elektronmikroskop. (E) Högre magnifblue bild av HSC visar subcellulära strukturer. (F) Högre förstoring bild av mitokondrier från HSPC. Skala bar: A / B, 100 pm; C, 10 ^ m; D, 2 | j, m; E / F, 500 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod gör det möjligt för TEM-analys på låga cellantal, med hjälp av Evans blå färgning och agaros bädda att lokalisera en liten cellpelleten under uttorkning, harts inbäddning och snittning processer. Viktigare, bibehåller den cellkluster tillsammans och bevarar cellultrastruktur, vilket är önskvärt att undersöka multipla celler för kvantifiering av data.
I TEM studier är en cellpellet innehållande miljontals celler ofta krävs för effektiv inbäddning i en agaros / gelatinmatris och tvättar, uttorkning och infiltration att hämta data från ett stort antal celler. Forskare har antagit immobilisering av cellsuspensionen i en BSA-bisakrylamid polymeriserat harts, färgning av monolager på en tunn support, eller cytospins för TEM-analys på låga cellantal / knappa prover 4-6. Det är dock fortfarande en långtråkig arbete för att lokalisera och skär celler under TEM på grund av den glesa fördelningen av cellerna inom matrisen ocheventuella förändringar av cellmorfologi, på grund av spridning och en klyvning mellan cellerna under cytospin preparat som ofta krävs åter inbäddning innan snittning. Dessutom monolagret fortfarande svårt att lokalisera för sektionering 11. Således är mycket lättare för TEM-analys 1 en cellpellet även från knappa biologiska prover av låg cellnummer.
Denna metod innebär en betydande fördel med tidigare publicerade metoder 4,5 i fråga om kvalitativ och kvantitativ ultrastrukturanalys från begränsade prover. Tillsammans beskriver detta protokoll ett effektivt sätt att lokalisera cellpellets för TEM med hjälp av Evans blå, vilket gör provet bearbetning från låga cellantal lätt för TEM för att möjliggöra kvalitativa och kvantitativa data analys. Typiskt provberedning för TEM kräver ett större antal celler än vad som vanligtvis krävs för ljusmikroskop, på grund av de många stegen i prov behandling feller TEM och korrekt orientering av cellblocket för skärning i rätt läge 1,10.
Det är känt att efter fixering osmification ger en bättre kontrast i bilder, i synnerhet de av membran och glykogenpartiklar under ett elektronmikroskop 9, och ytterligare stöd färgning med uranylacetat, ett relativt icke-specifikt färgämne för proteiner, och blycitrat som fläckar membran, nukleinsyror och glykogen. Emellertid är nästan omöjligt att utföra med knappa biologiska prover i suspension efter förhands inbäddning i BSA-BA osmification beroende på den höga sannolikheten för provförlust vid snittning och matris mörknar. Därmed kvaliteten på elektronmikroäventyrades i tidigare studier 4,9. Osmification här ledde till mörkfärgning av cellpelleten med minimal förändring av färgen på agaros. Sålunda medger föreliggande protokoll osmification efter förbehandling inbäddning i agaros för att ge god kontrast i TEM imåldrar.
Cellkluster var ganska enkelt att analysera med elektronmikroskopi med användning av denna metod. Pre-färgning med Evans blå bidragit till att lokalisera små cellpelletar under provberedning utan att påverka underorganell cell detaljer. Denna metod erbjuder ett alternativt tillvägagångssätt för provberedning för att framgångsrikt utföra TEM-analys från låga cellantal. I denna metod, var TEM-analys effektivt utföras med användning av celler av en liten storlek (5-8 ^ m). Således kan lätt antas denna metod med ännu lägre celltal (~ 1000 celler) av större celler såsom fibroblaster och endotelceller. Även Evans blå inte påverkar sub-organell cell detaljer i den aktuella studien, har användningen av Evans blå för immun guld elektronmikroskopi med låga cellantal inte testats.
Tillsammans är en effektiv metod för provberedning för att utföra TEM studier från en låg antalet celler som beskrivs. TEM studier krävs för att avslöja critical information om morfologi och ultra-strukturer i celler. Därför är ultra-strukturell information ofta saknas på olika knappa cellpopulationer. Detta alternativ och ny metod för provberedning kan vara till hjälp att utföra TEM studier från någon sällsynt cellpopulation. Dessutom medger denna metod kvalitativa och kvantitativa data från analys av cellkluster. Som elektronmikroskopi erbjuder oöverträffade detaljer i cellen ultra struktur och organisation, kommer denna metod att vara ganska bra att förstå många biologiska processer på knappen, men sällsynt, cellpopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 °C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic Petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
References
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
- Leapman, R. D.
- Anderson, D. R. A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy. J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).
- Taupin, P. Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy. Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).
- Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy. J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).
- Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).
- Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations. J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).
- Hopwood, D. The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks. Histochemistry. 24, 50-64 (1970).
- Saini, R., et al. Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies. J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).
- Kumar, S., et al. The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation. J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).
