Lo screening per Endocrine attività in acqua mediante disponibili in commercio<em> In Vitro</em> Transattivazione Bioassays

Summary

A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested (“freeze and thaw”) in vitro transactivation bioassays.

Abstract

Nel test biologici transattivazione in vitro hanno mostrato risultati promettenti come strumenti di monitoraggio della qualità delle acque, ma la loro adozione e l'applicazione diffusa è stata ostacolata in parte a causa della mancanza di metodi e disponibilità di robusta, tecnologia user-friendly standardizzati. In questo studio, disponibili in commercio, linee cellulari di divisione-arrestati sono stati impiegati per lo screening quantitativo per l'attività endocrina di sostanze chimiche presenti nei campioni di acqua di interesse per i professionisti di qualità ambientale. Un unico, protocollo standardizzato che comprendeva garanzia della qualità / controllo della qualità (QA / QC) controlli è stato sviluppato per l'attività degli estrogeni e glucocorticoidi recettore (ER e GR, rispettivamente) con un saggio basato su cellule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). I campioni di trattamento degli effluenti acque reflue urbane e delle acque di superficie dai sistemi di acqua dolce in California (USA), sono stati estratti con estrazione in fase solida e analizzati per l'attività endocrina utilizzando il proto standardizzatocol. Background e dose-risposta per le sostanze chimiche di riferimento specifici per endpoint soddisfatte le linee guida QA / QC ritenute necessarie per la misurazione affidabile. La risposta di screening test biologico per i campioni d'acqua di superficie non era in gran parte rilevabile. Al contrario, i campioni effluenti degli impianti di trattamento secondario hanno avuto la più alta attività misurabile, con concentrazioni equivalenti stimata saggi biologici (BEQ) fino a 392 ng desametasone / L per GR e 17 ng 17β-estradiolo / L per ER. La risposta saggio biologico per un campione effluente terziaria era inferiore a quello misurato per effluenti secondari, che indica un residuo inferiore di sostanze chimiche attive a livello endocrino dopo il trattamento avanzato. Questo protocollo ha dimostrato che nei biotest transattivazione vitro che utilizzano disponibili in commercio, Divisione cellulare-arrestato "kit", può essere adattato per lo screening per l'attività endocrina in acqua.

Introduction

monitoraggio della qualità dell'acqua corrente si basa sulla capacità di misurare con precisione e con precisione la presenza di contaminanti chimici come proxy per l'esposizione per la fauna selvatica e gli esseri umani. Tuttavia, questo monitoraggio chimico-by-chimiche e paradigma di valutazione non può tenere il passo con la continua evoluzione dell'universo chimico che abbiamo di fronte. Come impariamo di più sul destino e gli effetti delle sostanze chimiche di sintesi e naturali, continuiamo a cercare strumenti di misurazione che si rivolgono attesi impatti biologici, e che allo stesso tempo sono immuni da cambiamenti nella produzione di prodotti chimici, l'utilizzo e l'ingresso ambientale. Tali strumenti sono particolarmente rilevanti per la comprensione se sconosciute o nuove sostanze chimiche e prodotti di trasformazione, meritano la nostra attenzione. Inoltre, miscele complesse di sostanze chimiche presenti nell'acqua sono scarsamente affrontate da monitoraggio chimico individuale. Così, ci troviamo di fronte alla sfida di modernizzazione degli strumenti di monitoraggio esistente per affrontare meglio questi problemi nelle acque superficiali that ricevere scarico degli effluenti acque reflue trattate e deflusso / acque piovane urbane.

Negli ultimi anni, le tecniche bioanalitici hanno mostrato risultati promettenti come strumenti di screening per la valutazione della qualità delle acque. In particolare, biotest in'vitro che rispondono alle sostanze chimiche che agiscono tramite noto, i modi d'azione specifici ^1,2 sono di grande interesse per la comunità monitoraggio ambientale ^3. Numerose indagini hanno impiegato in test biologici in vitro per quantificare l'attività endocrina di bere, di superficie e acque di scarico ^{4 -6.} Inoltre, una serie di saggi biologici bersaglio eventi scatenanti molecolari (ad esempio, il recettore di attivazione) che potenzialmente possono essere associati ad effetti deleteri via via negativo esito analisi ^7,8.

L'evoluzione della bioscreening per la valutazione della qualità delle acque è stato relativamente rapido, con centinaia di diverso in endpoint saggi biologici in vitro sono state esaminate per la loroutility ^9,10. Attualmente, solo una manciata di test biologici hanno dimostrato di ottenere una buona precisione di misura (nei laboratori), dimostrando la capacità di differenziare tra qualità dell'acqua ^5,6. Per effluenti acque reflue trattate, in particolare, la presenza di estrogeni e steroidi glucocorticoidi è stata valutata con successo nei test in vitro di transattivazione ^11,12. test biologici Tuttavia, la maggior parte degli studi fino ad oggi hanno dipendenti la cui cella linee sono di proprietà (e quindi non largamente disponibile), necessitano di cure continue e di manipolazione, o entrambi. Di conseguenza, la capacità di standardizzare i protocolli, eseguire interlaboratorio esercizi di calibrazione, e in ultima analisi, di trasferire questa tecnologia di screening per le risorse idriche della comunità rimane ostacolato.

Almeno un fornitore di test biologici in vitro controllati attraverso il programma degli Stati Uniti ToxCast è disponibile in commercio in ¹³ facili da usare "gelo e disgelo4; formati. Queste cellule "kit" di divisione-arrestati hanno dimostrato di essere robusto in misurando l'attività di sostanze chimiche estratte dall'acqua che rappresentano diversi livelli di trattamento ^14. Sebbene i protocolli vendor sono disponibili per schermare la bioattività di singoli prodotti chimici o miscele, alcuni di essi richiedono la modifica prima che possano essere applicati a campioni di acqua. Trattata acque reflue effluenti ^15, deflusso delle acque piovane ^16, ricevendo le acque ^17,18 e, più recentemente riciclato ^19,20 acqua sono i principali esempi di mezzi acquosi che sono di interesse per la comunità della qualità delle acque.

Questo studio presenta un unico protocollo standardizzato per misurare l'attività endocrina in campioni di acqua utilizzando disponibili in commercio, divisione arrestato in saggi biologici transattivazione vitro. Abbiamo dimostrato la robustezza del protocollo attraverso una valutazione globale di sfondo, responsività dose e la ripetibilità di risposta per twO endpoint di particolare interesse e di estrogeni glucocorticoidi recettore transattivazione (ER e GR, rispettivamente). Il protocollo è stato applicato a campioni dello schermo di effluenti acque reflue trattate e delle acque di superficie dai sistemi d'acqua dolce in California.

Protocol

1. Raccogliere e Sample Water Process (Modificata da Escher et al. 9) Riempire un 1 L bottiglia di vetro ambra pulita contenente 1 g di sodio azide e acido ascorbico 50 mg verso l'alto con il campione di interesse. Conservare il campione a 4 ° C e di processo all'interno di 72 ore. NOTA: Il sodio azide è altamente tossico e deve essere maneggiato con cautela. Utilizzare equipaggiamento protettivo (per occhi / viso, guanti, abbigliamento) e pesare in un corretto funzionamen…

Representative Results

Nel presente studio, 4x 24 hr campioni compositi di trattamento degli effluenti acque reflue urbane, 6 campioni prelevati di acque superficiali provenienti da sistemi di acqua dolce nel sud della California e un campo vuoto costituito da acqua ultrapura sono stati selezionati per illustrare questo protocollo. 3 dei campioni 4 effluenti provenivano da impianti convenzionali di trattamento dei fanghi attivati ​​acque reflue ( "effluente secondario"), e il quarto da una pianta…

Discussion

La potenza ben documentata di estrogeni ambientali, come 17β-estradiolo (E2), lo screening mandati di queste sostanze chimiche in ng / L concentrazioni ^23,24. In questo studio, la risposta ER per gli effluenti di acque reflue (gamma BEQ: 2,3-17 ng E2 / L) era un po 'superiore a quello riportato per effluente secondario da WWTPs australiani ^20, mentre i BEQ per le acque superficiali (<0,5 a 4 ng E2 / L ) erano nel range riportato per superficie e delle acque piovane altrove (<1 a 11 ng E2…

Materials

GeneBLAzer ER alpha DA assay kit	ThermoFisher	K1393	Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.
GeneBLAzer GR DA assay kit	ThermoFisher	K1391	Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.
PrestoBlue cell viability reagent	ThermoFisher	A-13261
Trypan blue, 0.4% in PBS	Sigma-Aldrich	T8154	Also available at ThermoFisher
Corning 96 well black wall, clear-bottom plate	Corning	3603	Individually wrapped, sterile with lid
Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM	Sigma-Aldrich	WHA1820025
Microplate aluminum sealing film	E&K Scientific	T592100
Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent	Waters	WAT106202
17β Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	CAS #50-28-2
Ascorbic acid	Fisher Scientific	A61-100	Also available at Sigma-Aldrich
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	CAS #50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Molecular grade
Solvents (acetone, hexane, methanol)	Fisher Scientific		HPLC grade
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fumehood. Also available at EMD Millipore.
Automated cell counter or hemocytometer	Various*		Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher.
Class II biological safety cabinet	Various*
CO2 incubator	Various*
Cryogenic freezer	Various*		Liquid nitrogen storage dewar is recommended.
Fluorescence microplate reader	Various*		The reader must have bottom read capabilities.
* No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space.