Screening op hormonale activiteit in water met behulp van de handel verkrijgbare<em> In Vitro</em> Transactivering Bioassays
Summary
A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested (“freeze and thaw”) in vitro transactivation bioassays.
Abstract
In vitro transactivatie bioassays hebben aangetoond belofte als de waterkwaliteit controle-instrumenten, maar hun goedkeuring en de wijdverbreide toepassing is gedeeltelijk gehinderd door een gebrek aan gestandaardiseerde methoden en de beschikbaarheid van robuuste, gebruiksvriendelijke technologie. In deze studie werden commercieel beschikbare-divisie gearresteerd cellijnen toegepast om kwantitatief screenen op hormonale activiteit van chemicaliën aanwezig in watermonsters interesse milieukwaliteit professionals. Een enkele, gestandaardiseerd protocol dat uitgebreide kwaliteitsborging / kwaliteitscontrole inbegrepen (QA / QC) controles is ontwikkeld voor Oestrogeen en glucocorticoïde receptor-activiteit (ER en GR, respectievelijk) met behulp van een cel-gebaseerde Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) assay. Monsters van de behandelde afvalwater effluent en oppervlaktewater van zoetwatersystemen in Californië (USA), werden geëxtraheerd met behulp van vaste fase extractie en geanalyseerd op hormonale activiteit met de gestandaardiseerde protocol. Achtergrond en de dosis-respons voor endpoint-specifieke verwijzing chemicaliën voldaan QA / QC-richtlijnen voor een betrouwbare meting noodzakelijk wordt geacht. De biologische screening respons voor oppervlaktewater monsters was grotendeels niet aantoonbaar. In tegenstelling effluent monsters van secundaire zuiveringsinstallaties had de hoogste meetbare activiteit, met een geschatte bioassay equivalente concentraties (BEQ) tot 392 ng dexamethason / l voor GR en 17 ng 17β-estradiol / L ER. De biologische respons voor een tertiaire effluent steekproef was lager dan die gemeten voor het secundair afvalwater, wat wijst op een lagere residu van endocriene actieve stoffen na geavanceerde behandeling. Dit protocol is gebleken dat in vitro bioassays transactivatie die commercieel verkrijgbaar benutten-divisie gearresteerd cell "kits", kan worden aangepast om te screenen op endocriene werking in water.
Introduction
De huidige monitoring van de waterkwaliteit is gebaseerd op het vermogen om nauwkeurig en precies meten van de aanwezigheid van chemische contaminanten als een proxy voor de blootstelling aan wilde dieren en de mens. Dit kan echter chemisch-by-chemische monitoring en evaluatie paradigma geen gelijke tred met de steeds veranderende chemische universum dat we onder ogen zien. Als we meer over het lot en de gevolgen van synthetische en natuurlijke chemicaliën te leren, blijven we zoeken naar meetinstrumenten die pakken verwachte biologische effecten, en dat op hetzelfde moment immuun zijn voor veranderingen in de chemische productie, het gebruik en omgevingsfactoren ingang. Dergelijke hulpmiddelen zijn vooral van belang voor het begrijpen of onbekende of nieuwe chemische stoffen en omzettingsproducten, verdienen onze aandacht. Bovendien zijn complexe mengsels van chemicaliën aanwezig in het water slecht aangepakt door individuele chemische monitoring. Zo staan we voor de uitdaging van de modernisering van de bestaande controle toolbox om beter aan te pakken deze problemen in het oppervlaktewater that ontvangen lozing van gezuiverd afvalwater effluent en stedelijke / regenwaterreproductie.
In de afgelopen jaren zijn bio-analytische technieken aangetoond belofte als screening instrumenten voor de beoordeling van de waterkwaliteit. In het bijzonder, in'vitro bioassays die reageren op chemische stoffen die werken via bekende, specifieke werkingsmechanismen 1,2 zijn van groot belang voor het toezicht op het milieu gemeenschap 3. Talloze onderzoeken hebben gebruikt in vitro bioassays om de hormonale activiteit van het drinken, oppervlakte- en afvalwater 4 -6 kwantificeren. Bovendien is een aantal bioassays doelmolecuulgewicht initiërende gebeurtenissen (bijvoorbeeld receptor activering) die mogelijk kunnen dienen schadelijke effecten via negatieve uitkomst pad analyses 7,8.
De evolutie van bioscreening voor de beoordeling van de waterkwaliteit is relatief snel geweest, met honderden verschillende in vitro bioassay eindpunten zijn geëvalueerd op hunhulpprogramma 9,10. Op dit moment zijn er slechts een handvol van de bioassays is aangetoond dat ze goede meetnauwkeurigheid (binnen laboratoria) te bereiken, terwijl het aantonen van de mogelijkheid om onderscheid te maken tussen water kwaliteiten 5,6. Voor gezuiverd afvalwater effluent in het bijzonder, heeft het optreden van oestrogenen en glucocorticoïden steroïden met succes verantwoord op basis van in-vitro-transactivatie assays 11,12. De meeste studies tot op heden toegepaste bioassays waarvan cellijnen proprietary (en dus niet overal beschikbaar), vereisen voortdurende zorg en manipulatie, of beide. Als gevolg daarvan, de mogelijkheid om protocollen te standaardiseren, het uitvoeren van inter-laboratorium kalibratie oefeningen, en uiteindelijk tot deze screening technologie over te dragen aan de waterreserves gemeenschap blijft gehinderd.
Ten minste één leverancier van biologische in vitro testen doorgelicht door het Amerikaanse ToxCast programma is in de handel verkrijgbaar 13 in gemakkelijk te bevriezen en ontdooien gebruiken "4; formats. Deze cel-deling gearresteerd "kits" bleken robuust meten van de activiteit van chemische stoffen onttrokken water die verschillende niveaus van de behandeling 14 te zijn. Hoewel verkoper protocollen zijn beschikbaar om de bioactiviteit van afzonderlijke chemische stoffen of mengsels screenen, sommige moeten worden gewijzigd alvorens ze kunnen worden toegepast watermonsters. Gezuiverd afvalwater effluent 15, regenwaterreproductie 16, de ontvangende wateren 17,18 en meer recentelijk gerecycleerd water 19,20 zijn goede voorbeelden van waterige media, die van belang zijn voor de kwaliteit van het water gemeenschap.
Deze studie geeft een enkele, gestandaardiseerd protocol om de hormonale activiteit in watermonsters te meten met behulp van in de handel verkrijgbare,-divisie gearresteerd in vitro transactivatie bioassays. We hebben aangetoond robuustheid van het protocol door middel van een uitgebreide beoordeling van de achtergrond, de dosis responsiviteit en herhaalbaarheid van respons voor two eindpunten van bijzonder belang Estrogen and Glucocorticoid Receptor transactivatie (ER en GR, respectievelijk). Het protocol werd toegepast op het scherm monsters van gezuiverd afvalwater afvalwater en oppervlaktewater van zoetwatersystemen in Californië.
Protocol
Representative Results
Discussion
De goed gedocumenteerde potentie van oestrogenen uit de omgeving, zoals de 17β-estradiol (E2), warrants screening voor deze chemicaliën in ng / l concentraties 23,24. In deze studie, de ER respons voor afvalwater afvalwater (BEQ range: 2,3-17 ng E2 / L) was iets hoger dan gerapporteerd voor secundair afvalwater van Australische RWZI's 20, terwijl de BEQ voor oppervlaktewater (<0,5 tot 4 ng E2 / L ) waren binnen de gerapporteerde voor oppervlakte- en regenwater elders (<1 tot 11 ng E2 / …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by State Water Resources Control Board (Agreements No. 10-096-250 and 14-090-270). We thank S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi, and J. Printen. The authors declare no conflict of interest, and reference to trade names does not imply endorsement.
Materials
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96 well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fumehood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. | |||
References
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data. Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).
- Maruya, K. A., et al. A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems. Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).
- Van der Linden, S. C., et al. Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).
- Leusch, F. D. L., et al. Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters. Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).
- Jarosova, B., et al. Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).
- Sonneveld, E., et al. Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities. Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).
- Piersma, A. H., et al. Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants. Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).
- Escher, B. I., et al. Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays. Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).
- U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. . Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools. , (2012).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses. Water Res. 50, 420-431 (2014).
- Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment. Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).
- Huang, R., et al. Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors. Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).
- Mehinto, A. C., et al. Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water. Water Res. 83, 303-309 (2015).
- Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment. Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).
- Tang, J. Y. M., et al. Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools. Water Res. 47, 5594-5606 (2013).
- Scott, P. D., et al. An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).
- Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water. Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).
- WateReuse Research Foundation (WRRF). . Direct potable reuse: a path forward. , (2011).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water. Water Res. 49, 300-315 (2014).
- Schriks, M., et al. Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands. Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).
- Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan. Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).
- Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works. Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).
- Kidd, K. A., et al. Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).
- Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells. Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).
- Kugathas, S., Sumpter, J. P. Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish. Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).
- Van der Linden, S. C., et al. Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).
- Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk. Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).
