A Simple Fluorescens Assay for Kvantificering af Canine Neutrofil Ekstracellulær Trap Frigivelse
Summary
Neutrofile ekstracellulære fælder (net) er netværk af DNA, histoner og neutrofile proteiner. Selv om en del af den medfødte immunreaktion, er NET impliceret i autoimmunitet og trombose. Denne protokol beskriver en enkel fremgangsmåde til hunde neutrofil isolering og kvantificering af NET bruger mikroplade fluorescens-assay.
Abstract
Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.
Introduction
Der er over 70 mio hunde i USA alene en. Som værdsatte familiemedlemmer, disse dyr ofte modtager banebrydende lægehjælp. Lige så fordi de deler vores miljø, kan hunde give indsigt i patogenesen og behandling af sygdomme hos mennesker en. Men hvorvidt oversætte opdagelser i humanmedicin i veterinære behandlinger eller omvendt, er det vigtigt at grundigt karakterisere artsvariationer selv i stærkt konserverede systemer såsom det medfødte immunreaktion. Eksempler på forskelle mellem hunde og menneskers medfødte immunsystem omfatter høj ekspression CD4 på hund neutrofiler 2; fraværet af en funktionel homolog af den cytoplasmatiske flagellin sensor IPAF hos hunde 3 og ekspressionen af en caspase 1/4 hybrid i kødædere 4.
Neutrofile ekstracellulære fælder (net) er en relativt nylig opdaget komponent af medfødte immunitet 5. NET er netværks af DNA, nukleare og kornede proteiner frigivet som reaktion på en bred vifte af inflammatoriske eller infektiøse stimuli 6. NET-lignende strukturer er blevet påvist på tværs af mange arter, herunder kyllinger 7, fisk 8, bløddyr 9 og acoelomates 10, men der er artsvariationer. For eksempel murine neutrofiler reagere langsommere til NETosis stimuli end humane neutrofiler, og danner mindre diffuse NET 11. Der er en stor mængde dokumentation fra flere arter, som NET indeslutter mikrober, og mere kontroversielt kan være direkte involveret i drab patogener 12,13. Men NET komponenter også øge vævsskader, fremme trombose og fungere som autoantigener 14,15. Balancen mellem de gavnlige og skadelige virkninger af NET kan variere mellem forskellige sygdomme og forskellige arter, hvilket tyder på at det er vigtigt at undersøge NET både i beskaffenhed og tilstand af interesse.
Her er vibeskrive en enkel protokol til at fremkalde og måle frigivelse af NET med hunde neutrofiler. Denne metode svarer til dem, der anvendes til at isolere neutrofiler 16 og inducere NETosis i andre arter, men forhold såsom agonist koncentration og inkubationstid er blevet optimeret til hunde neutrofiler. En lignende NET kvantificering DNA frigivelsesassay er også blevet beskrevet i andre arter men metoden præsenteres her er også optimeret til hunde 8,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA frigivelsesassay fremlagt er en let kvantificerbar assay for ekstracellulært DNA. Metoden blev tilpasset fra lignende teknikker anvendes til at vurdere NET dannelse i andre arter, men centrifugeringshastigheder, agonist koncentrationer og inkuberingstider er blevet ændret for at optimere metoden til anvendelse med hunde neutrofiler 8,17,18. Lignende justeringer kan foretages for at tilpasse fremgangsmåden til andre arter. Assayet er ligetil og billig sammenlignet med andre metoder til måling NETosis s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge Drs James Roth, William Nauseef and Kayoko Kimura and Mr Tom Skadow for assistance with development of the canine neutrophil protocols. RDG is supported by a Wellcome Trust Fellowship ref: WT093767MA.
Materials
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673 (2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
- Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
- Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
- Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
- Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627 (2014).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore?. Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
- Martinod, K., Wagner, D. D. Thrombosis: tangled up in NETs. Blood. 123 (18), 2768-2776 (2014).
- Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
- Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12 (2013).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).
