ואלקטרופורזיס פשוט עבור כימות של שחרור מלכודת לכלבים נויטרופילים תאיים
Summary
מלכודות תאי נויטרופילים (נטס) הן רשתות של DNA, ההיסטונים וחלבונים נויטרופילים. למרות מרכיב של התגובה החיסונית המולדת, רשתות מעורבות אוטואימוניות פקק. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד נויטרופילים כלבי וכימות של רשתות באמצעות assay קרינת microplate.
Abstract
Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.
Introduction
ישנם מעל 70 מיליון כלבים בארה"ב בלבד 1. כמו בני משפחה מוערך, החיות האלה זוכים לעיתים קרובות חיתוך טיפול רפואי קצה. פחות בגלל שהם חולקים הסביבה שלנו, כלבים יכולים לספק תובנות בפתוגנזה וטיפול של מחלות אנושיות 1. עם זאת, אם תרגום תגליות ברפואה אנושית לתוך טיפולים וטרינריים או להיפך, חשוב לאפיין ביסודיות מיני וריאציות אפילו במערכות שמורות ביותר כמו התגובה החיסונית המולדת. דוגמאות של הבדלים בין הכלבים לבין מערכת חיסון מולדת אנושית כוללות ביטוי גבוה CD4 על נויטרופילים כלב 2; בהעדר homolog תפקודית של IPAF חיישן flagellin ציטופלסמית בכלבים 3 ואת הביטוי של הכלאה caspase 1/4 ב טורפים 4.
מלכודות תאי נויטרופילים (רשתות) הם מרכיבים גילה יחסית לאחרונה של חסינות מולדת 5. הנטס הוא רשתהים של דנ"א, חלבונים גרעיניים ופרטניים פרסמו בתגובת מגוון רחב של גירויים דלקתיים או זיהומיות 6. NET מבנים דמויי הודגמו פני מינים רבים, כולל תרנגולות 7, דגים 8, רכיכות 9 ו acoelomates 10, אבל יש וריאציות מינים. לדוגמה, נויטרופילים murine להגיב לאט יותר לגירויים NETosis מ נויטרופילים אדם, ויוצרים פחות מפוזר 11 נטס. ישנו גוף גדול של עדויות מינים רבים כי רשתות ללכוד חיידקים, ועוד שנויות במחלוקת עשויה להיות מעורבות ישירות להרוג פתוגנים 12,13. עם זאת, רכיבים NET גם לשפר נזק לרקמות, לקדם פקקת ולפעול עצמיים 14,15. האיזון בין ההשפעות החיוביות המזיקות של רשתות עשוי להשתנות בין מחלות שונות ומינים שונים, דבר המצביע חשוב לחקור רשתות הן המין ומצבו של עניין.
הנה אנחנומתאר פרוטוקול פשוט גרימה ומדידת שחרור נטס על ידי נויטרופילים כלבים. שיטה זו דומה לאלה המשמשים לבודד נויטרופילים 16 ולגרום NETosis במינים אחרים, אך התנאים כגון ריכוז אגוניסט וזמן הדגירה ממוטבים עבור נויטרופילים כלבים. Assay לשחרור DNA כימות NET דומה אף תואר במינים אחרים אבל השיטה המוצגת כאן גם מותאמת במיוחד עבור כלבים 8,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
את assay לשחרור DNA שהוצג הוא assay לכימות בקלות עבור DNA התאי. השיטה הותאמה מן בטכניקות דומות המשמשות להערכת היווצרות NET במינים אחרים, אך במהירויות צנטריפוגה, ריכוזי אגוניסט ושעות דגירה שונו כדי לייעל את השיטה לשימוש עם נויטרופילים כלבי 8,17,18. התאמות דומות יכולות להיעש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge Drs James Roth, William Nauseef and Kayoko Kimura and Mr Tom Skadow for assistance with development of the canine neutrophil protocols. RDG is supported by a Wellcome Trust Fellowship ref: WT093767MA.
Materials
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673 (2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
- Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
- Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
- Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
- Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627 (2014).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore?. Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
- Martinod, K., Wagner, D. D. Thrombosis: tangled up in NETs. Blood. 123 (18), 2768-2776 (2014).
- Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
- Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12 (2013).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).
