En enkel fluorescensanalys för kvantifiering av Canine neutrofila Extracellulär Trap Release
Summary
Neutrofila extracellulära fällor (NET) är nätverk av DNA, histoner och neutrofila proteiner. Även om en komponent av den medfödda immunsvar, är nät inblandade i autoimmunitet och trombos. Detta protokoll beskriver en enkel metod för canine neutrofil isolering och kvantifiering av NET med användning av en mikroplattfluorescensanalys.
Abstract
Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.
Introduction
Det finns över 70 miljoner hundar i USA enbart en. Som värderas familjemedlemmar, ofta dessa djur mottar framkant sjukvård. Lika eftersom de delar vår miljö, kan hundar ge insikter i patogenesen och behandlingen av sjukdomar hos människor 1. Men om översätta upptäckter inom humanmedicinen i veterinärbehandlingar eller vice versa, är det viktigt att noggrant karakterisera arter variationer även i starkt konserverade system som det medfödda immunförsvaret. Exempel på skillnader mellan hund och människa medfödda immunsystemet inkluderar hög expression CD4 på hund neutrofiler 2; frånvaro av en funktionell homolog av den cytoplasmatiska flagellin sensorn IPAF hos hundar 3 och uttryckningen av en kaspas 04/01 hybrid i köttätare 4.
Neutrofila extracellulära fällor (NET) är en relativt nyligen upptäckt komponent av medfödd immunitet 5. NET är nätverkss av DNA, nukleära och granulära proteiner som frisätts som svar på ett brett spektrum av inflammatoriska eller infektiösa stimuli 6. Nätliknande strukturer har visats i många arter, inklusive kycklingar 7, fisk 8, blötdjur 9 och acoelomates 10, men det finns variationer arter. Till exempel murina neutrofiler reagerar långsammare på NETosis stimuli än humana neutrofiler och bilda mindre diffusa NET 11. Det finns en stor mängd bevis från flera arter som NET innesluter mikrober, och mer kontroversiellt kan vara direkt involverad i att döda patogener 12,13. Men NET komponenter ökar också vävnadsskada, främja trombos och fungera som autoantigen 14,15. Balansen mellan de positiva och negativa effekter av NET kan variera mellan olika sjukdomar och olika arter, vilket tyder på att det är viktigt att undersöka NET både i arter och tillstånd av intresse.
Här vibeskriva ett enkelt protokoll för att inducera och mäta frisättningen av NET med hund neutrofiler. Denna metod liknar de som används för att isolera neutrofiler 16 och inducerar NETosis i andra arter, men tillstånd såsom agonistkoncentration och inkubationstid har optimerats för hund neutrofiler. En liknande NET kvantifiering DNA frisättningsanalys har även beskrivits i andra arter, men metoden som presenteras här är också optimerad för hundar 8,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analys DNA frisättning presenteras är en lätt kvantifierbart analys för extracellulärt DNA. Metoden anpassades från liknande tekniker används för att bedöma NET bildning i andra arter, men centrifugeringshastigheter, agonist koncentrationer och inkubationstider har ändrats för att optimera metoden för användning med canine neutrofiler 8,17,18. Liknande justeringar kan göras för att anpassa metoden för andra arter. Analysen är enkel och billig i jämförelse med andra metoder för att mäta NE…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge Drs James Roth, William Nauseef and Kayoko Kimura and Mr Tom Skadow for assistance with development of the canine neutrophil protocols. RDG is supported by a Wellcome Trust Fellowship ref: WT093767MA.
Materials
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673 (2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
- Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
- Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
- Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
- Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627 (2014).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore?. Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
- Martinod, K., Wagner, D. D. Thrombosis: tangled up in NETs. Blood. 123 (18), 2768-2776 (2014).
- Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
- Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12 (2013).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).
