Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques.
Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich meal, which consists of an emulsion of chicken egg yolk liposomes created by sonicating egg yolk in embryo media. Detailed instructions are provided to screen larvae for egg yolk consumption so that larvae that fail to feed will not confound experimental results. The chicken egg yolk liposomes can be spiked with fluorescent lipid analogs, including fatty acids and cholesterol, enabling both systemic and subcellular visualization of dietary lipid processing. Several methods are described to mount larvae that are conducive to short- and long-term live imaging with both upright and inverted objectives at high and low magnification. Additionally presented is an assay to quantify larval food intake by extracting the lipids of larvae fed fluorescent lipid analogs, spotting the lipids on a thin layer chromatography plate, and quantifying the fluorescence. Finally, critical aspects of the procedures, important controls, options for modifying the protocols to address specific experimental questions, and potential limitations are discussed. These techniques can be applied not only to focused, hypothesis driven inquiries, but also to a variety of screens and live imaging techniques to study dietary lipid metabolism and the control of food intake.
तंत्र है जिसके द्वारा आंत को नियंत्रित आहार लिपिड प्रसंस्करण, जिगर को नियंत्रित जटिल लिपिड संश्लेषण और लिपोप्रोटीन चयापचय, और कैसे इन अंगों केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के साथ काम भोजन का सेवन को नियंत्रित करने के अधूरे समझ रहे हैं। यह मोटापा, हृदय रोग, मधुमेह, और गैर शराबी फैटी लीवर रोग की वर्तमान महामारी के प्रकाश में इस जीव विज्ञान स्पष्ट करने के लिए जैव चिकित्सा ब्याज की है। सेल संस्कृति में अध्ययन और चूहों आहार लिपिड और रोग, और zebrafish (Danio rerio) के बीच यंत्रवत संबंधों के बारे में हमारी समझ के बहुमत प्रदान किया है इस काम के पूरक के लिए एक आदर्श मॉडल के रूप में उभर रहे हैं।
Zebrafish, समान जठरांत्र (सैनिक) अंगों, लिपिड चयापचय, और लिपोप्रोटीन परिवहन उच्च रीढ़ 1,2 करने की जरूरत तेजी से विकसित करने, और आनुवंशिक रूप से विनयशील हैं। लार्वा zebrafish के ऑप्टिकल स्पष्टता विवो पढ़ाई में सुविधा है, एक particulaइसकी बाह्य वातावरण के रूप में सैनिक प्रणाली के अध्ययन के लिए आर लाभ (यानी, पित्त, माइक्रोबायोटा, अंत: स्रावी संकेतन) लगभग असंभव पूर्व vivo। अनुसार, साथ zebrafish लार्वा की इमेजिंग रहने के लिए आनुवंशिक शिक्षणीयता और conduciveness के संयोजन अनुसंधान के एक शरीर मॉडल के लिए है आहार जोड़तोड़ (उच्च वसा 3,4, -cholesterol 5, और -carbohydrate आहार 6.7), और हृदय रोग 8 के मॉडल की एक किस्म, मधुमेह 9,10, यकृत स्टीटोसिस 11-13, 14-16 और मोटापा, चयापचय अंतर्दृष्टि के एक मेजबान प्रदान करने के लिए उभर रहे हैं।
चयापचय अनुसंधान में लार्वा zebrafish संक्रमण का एक अनिवार्य पहलू zebrafish और उपन्यास assays कि zebrafish की अद्वितीय ताकत का फायदा उठाने के विकास के लिए अन्य मॉडल पशुओं में विकसित तकनीकों के अनुकूलन है। इस प्रोटोकॉल की तकनीक विकसित की है और अनुकूलित एक लिपि लार्वा zebrafish को खिलाने के लिए प्रस्तुत करता हैडी युक्त भोजन, subcellular संकल्प करने के लिए पूरे शरीर से आहार लिपिड प्रसंस्करण कल्पना है, और भोजन का सेवन को मापने। चिकन अंडे की जर्दी लिपिड युक्त भोजन रचना करने के लिए चुना गया था के रूप में यह वसा और कोलेस्ट्रॉल (लिपिड रचना ~ चिकन अंडे की जर्दी, ~ 5% है, जिनमें से कोलेस्ट्रॉल, ट्राइग्लिसराइड्स 60% कर रहे हैं, और 35% से 58% फॉस्फोलिपिड हैं के उच्च स्तर शामिल )। के रूप में zebrafish आहार और खिला रेजिमेंटों प्रयोगशालाओं 17 के पार मानकीकृत नहीं किया गया है चिकन अंडे की जर्दी, ठेठ व्यावसायिक zebrafish micropellet खाद्य पदार्थ (~ 15% लिपिड) और लाभ यह विशिष्ट फैटी एसिड प्रजातियों में से ज्ञात प्रतिशत के साथ एक मानकीकृत फ़ीड है कि अधिक से अधिक वसा प्रदान करता है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट लिपिड अंडे की जर्दी में प्रदान की analogs परिवहन और आहार लिपिड 18 के संचय, दोनों के रूप में महत्वपूर्ण रंगों 3 और जटिल लिपिड में सहसंयोजक समावेश के माध्यम से अभिनय से लिपिड बूंदों सहित छवि सेलुलर घटकों कल्पना, पतली परत क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से चयापचय की जांच (टीएलसी) 19 </sup> और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) (एसएएफ अप्रकाशित डेटा), और कुल भोजन का सेवन 20 के लिए एक मात्रात्मक परख प्रदान करते हैं।
तकनीक यहाँ वर्णित शोधकर्ताओं ने एक लिपिड युक्त फ़ीड के साथ लार्वा zebrafish इलाज लाइव लार्वा में आहार लिपिड प्रसंस्करण कल्पना, और लार्वा भोजन का सेवन यों की अनुमति देते हैं। सफलता सुनिश्चित करने के लिए विश?…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Meng-Chieh Shen for images, Jennifer Anderson for providing helpful comments on the manuscript, and members of the Farber laboratory for their contributions in developing these techniques. This study was funded by NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F), and F32DK096786 (J.P.O.). This content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of NIH. Additional support was provided by the G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation to the laboratory of S.A.F and the Carnegie Institution for Science endowment.
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anesthesia for larval zebrafish |
Chicken eggs | N/A | N/A | Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids |
Ultrasonic processor 3000 sonicator | Misonix, Inc. | S-3000 | To make egg yolk liposomes |
Sonabox acoustic enclosure | Misonix, Inc. | 432B | To make egg yolk liposomes |
1/8” tapered microtip | Misonix, Inc. | 419 | To make egg yolk liposomes |
Amber vials (4 ml, glass) | National Scientific | 13-425 | Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa |
Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Incubated shaker for feeds |
BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid) |
BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) |
BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid) |
BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid) |
TopFluor cholesterol | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol |
Fatty acid-free BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | For TopFluor cholesterol solubilization |
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm |
Low melt agarose | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Mounting media for live larval imaging; 22 x 30 |
VWR microscope slides | VWR | 16004-422 | Mounting larvae for live imaging |
Coverslips | Cover Glass | 12-544A | Mounting larvae for live imaging |
Super glue | Loctite | LOC01-30379 | Mounting larvae for live imaging |
FluoroDish (glass bottom dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness |
Confocal microscope | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscope for high magnification live imaging |
Stereoscope | Nikon | SM21500 | Microscope for low magnification live imaging |
Glass culture tubes | Kimble | 73500-13100 | Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml) |
Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Lipid extraction |
Channeled TLC plates | Whatman Scientific | WC4855-821 | Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued |
Channeled TLC plates | Analtech, Inc. | 66911 | Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates |
Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GE Healthcare | 9410 | Fluorescent plate reader for food intake assay |
ImageQuant software | GE Healthcare | 29000605 | Analysis of food intake assay |
5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets | Kimble | 63A53WT | Transfering larvae |