De indirecte Neuron-astrocyten Coculture Assay: An<em> In Vitro</em> Set-up voor het gedetailleerd onderzoek van het neuron-glia interacties
Summary
Dit protocol beschrijft de indirecte neuron-astrocyten co-cultuur voor verzuilde analyse van neuron-glia interacties.
Abstract
Proper neuronale ontwikkeling en de functie is een voorwaarde van de ontwikkelingslanden en de volwassen hersenen. De mechanismen waardoor sterk gecontroleerde vorming en instandhouding van complexe neuronale netwerken niet volledig tot nu toe begrepen. De onbeantwoorde vragen betreffende neuronen bij gezondheid en ziekte zijn divers en het bereiken van het begrijpen van de fundamentele ontwikkeling te onderzoeken menselijke pathologieën, bijvoorbeeld de ziekte van Alzheimer en schizofrenie. De gedetailleerde analyse van neuronen kan worden uitgevoerd in vitro. Echter, neuronen veeleisend cellen en moet de extra steun van astrocyten voor hun voortbestaan op lange termijn. Deze cellulaire heterogeniteit is in strijd met het doel om de analyse van neuronen en astrocyten ontleden. We presenteren hier een celkweek test die het mogelijk maakt voor de langdurige cocultivatie zuivere primaire neuronen en astrocyten, die dezelfde chemisch gedefinieerde medium doorgegeven, terwijl fysiekgescheiden. In deze opstelling, de kweken overleven tot vier weken en de bepaling is geschikt voor diverse onderzoeken inzake neuron-glia interactie.
Introduction
Gedurende de afgelopen decennia is de algemene interpretatie van neuroglia functie is ontstaan uit de toekenning van een louter ondersteunende naar een actieve regulerende rol met betrekking tot de neuronale functie 1. Vanwege hun prominente invloed op de hersenen homeostase in gezondheid en ziekte 2, astrocyten van bijzonder belang zijn voor de wetenschappelijke gemeenschap. In de afgelopen jaren diverse studies zijn gericht op neuron-glia interacties in vivo en in vitro 3. De meeste van de kweeksystemen niet voorziet in afzonderlijke analyse van beide celtypen en hun secretomen.
Verschillende manieren gebruik maken van de directe cocultivatie van neuronen en glia om langdurige overleving en fysiologisch relevante neuronale ontwikkeling van het netwerk 4-6 te bereiken. Het huidige protocol dezelfde doelen bereikt, terwijl beide celtypen fysiek gescheiden 7. Vergeleken met conditioned medium benadert 8,9, ons systeem maakt het mogelijk om de bidirectionele communicatie tussen neuronen en astrocyten te bestuderen. De expressie van uitgescheiden signaalmoleculen kan worden bewaakt terwijl de cellen rijpen in het gedeelde medium. Deze mogelijkheid is bijzonder relevant, aangezien astrocyten oplosbare factoren, zoals cytokinen, groeifactoren en extracellulaire matrix moleculen 10,11 loslaat, waardoor neuronale groeiregulerende en functie 7,12. Zo is aangetoond dat de toevoeging van thrombospondine retinale ganglion cellen in vitro induceert de vorming van synapsen 13. Echter, andere nog onbekende factoren noodzakelijk synapsen functionele 13 maken. Bovendien moleculen vrijgegeven door astrocyten moeten worden geïdentificeerd met het oog op basis van neuron-glia interacties te begrijpen.
De teelt van primaire neuronen en astrocyten uit muizen en ratten is eerder 14-16 beschreven. Hier Wijpresenteren een elegante en veelzijdige tool om beide celtypen te combineren in een indirecte coculture aanpak. Aangezien de twee culturen fysiek gescheiden zijn maar hetzelfde medium, het effect van neuronen, astrocyten en oplosbare moleculen delen kunnen afzonderlijk worden geanalyseerd, waardoor een krachtig hulpmiddel voor neuron-glia interactie studies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het belangrijkste doel van het huidige protocol is het volledig gescheiden neuronale en astrocytaire culturen, terwijl het handhaven ervan in gedeeld medium. Daarom moet de zuiverheid van de kweken verkregen wordt gecontroleerd bij het begin van de procedure. Wij raden het gebruik van neuron-specifieke tubuline, neurofilaments of Neun eiwit als neuronale markers, GFAP als astrocytaire marker, O4 antigeen oligodendrocyt precursor marker en Iba1 eiwit microglia te identificeren.
Besteed specia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 “Glia and Synapse”, Fa 159/11-1,2,3).
Materials
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-ß-D arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24 well plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro tube (2 ml) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 ml) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 ml) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
References
- Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
- Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury. Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Dityatev, A., et al. Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets. Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).
- Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny. Front Neuroeng. 4, 1 (2011).
- Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons. J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).
- Geissler, M., Faissner, A. A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays. J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).
- Yu, C. Y., et al. Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis. Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).
- Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth. Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).
- Kucukdereli, H., et al. Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC. PNAS. 108, E440-E449 (2011).
- Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay. Synapse. 65, 41-53 (2011).
- Navarrete, M., Araque, A. Basal synaptic transmission: astrocytes rule!. Cell. 146, 675-677 (2011).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).
- Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets. Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Pyka, M., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).
- Eroglu, C. The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function. J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).
- Ethell, I. M., Ethell, D. W. Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).
- Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A., Dityatev, A. l. e. x. a. n. d. e. r., Wehrle-Haller, B. e. r. n. h. a. r. d., Asla, P. i. t. k. &. #. 2. 2. 8. ;. n. e. n. . Prog Brain Res. 214, 3-28 (2014).
- Dityatev, A., Rusakov, D. A. Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse. Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse. JoVe. , (2010).
