Den Indirekte Neuron-astrocyte coculture analyse: En<em> In Vitro</em> Oppsett for detaljert undersøkelse av Neuron-gliaceller interaksjoner
Summary
Denne protokollen beskriver indirekte nevron-astrocyte coculture for compartmentalized analyse av nevron-gliaceller interaksjoner.
Abstract
Riktig neuronal utvikling og funksjon er en forutsetning for utvikling og den voksne hjernen. Imidlertid er mekanismene bak svært kontrollert dannelse og vedlikehold av komplekse nevrale nettverk som ikke er fullstendig forstått så langt. De åpne spørsmål angående nevroner i helse og sykdom er mangfoldige og nå fra å forstå den grunnleggende utvikling for å undersøke menneskerelaterte sykdommer, for eksempel Alzheimers sykdom og schizofreni. Den mest detaljerte analyser av neuroner kan bli utført in vitro. Imidlertid er neuroner krevende celler og trenger ekstra støtte av astrocytter for deres langtidsoverlevelse. Denne mobil heterogenitet er i strid med det formål å dissekere analyse av nevroner og astrocytter. Vi presenterer her en cellekultur-analyse som gjør det mulig for den langsiktige cocultivation av rene primære neuroner og astrocytter, som deler de samme kjemisk definert medium, mens den er fysiskseparert. I dette oppsettet, kulturer overleve i opptil fire uker, og analysen er egnet for et mangfold av undersøkelser vedrørende nevron-gliaceller interaksjon.
Introduction
Gjennom de siste tiårene har den generelle tolkningen av gliacelle funksjon utviklet seg fra tildeling av en bare støttende mot et aktivt regulerende rolle om nevronale funksjon 1. På grunn av sin fremtredende innvirkning på hjernen homeostase i helse og sykdom 2, astrocytter er av spesiell interesse for det vitenskapelige samfunnet. I de siste årene, har et mangfold av studier fokusert på nevron-gliaceller interaksjoner in vivo og in vitro tre. Men de fleste av de kultursystemer ikke gir mulighet for separat analyse av begge celletyper og deres respektive secretomes.
Flere tilnærminger utnytte direkte cocultivation av nevroner og gliaceller å oppnå langvarig overlevelse og fysiologisk relevant nevronale nettverk utvikling 4-6. Denne protokoll når de samme målene, samtidig som begge celletypene fysisk adskilte 7. Sammenlignet med conditioned medium tilnærminger 8,9, systemet gjør det mulig å studere toveis kommunikasjon mellom nevroner og astrocytter. Ekspresjon av utskilt signalmolekyler kan overvåkes mens cellene maturate i den felles medium. Denne muligheten er spesielt relevant, da astrocytter frigjør oppløselige faktorer, slik som cytokiner, vekstfaktorer og ekstracellulære matriks-molekyler 10,11, for derved å regulere neuronal vekst og funksjon 7,12. Det har således blitt vist at tilsetningen av thrombospondin til gangliecelle in vitro induserer dannelsen av synapser 13. Men andre ennå ukjente faktorer er nødvendig for å gjengi synapser funksjonelle 13. Videre molekyler utgitt av astrocytter har til å bli identifisert for å forstå grunnlaget for neuron-gliaceller interaksjoner.
Dyrking av primære neuroner og astrocytter fra mus og rotte har blitt beskrevet tidligere 14-16. her er vipresentere en elegant og allsidig verktøy for å kombinere begge celletyper i en indirekte coculture tilnærming. Siden de to kulturene er fysisk adskilt, men deler den samme medium, virkningen av neuroner, astrocytter og oppløselige molekyler, kan hver for seg analysert, og dermed skape et kraftig verktøy for neuron-glia interaksjonsstudier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hovedmålet med den nåværende protokollen er å helt separate nevronale og astrocytic kulturer, og samtidig opprettholde dem i delt medium. Av denne grunn bør renheten av kulturene som oppnås verifiseres ved begynnelsen av prosedyren. Vi anbefaler bruk av neuron-spesifikke tubulin, nevrofilamenter eller Neun protein som nevrale markører, GFAP som astrocytic markør, O4 antigen som oligodendrocyte forløper markør og Iba1 protein for å identifisere microglia.
Vær spesielt oppmerksom n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 “Glia and Synapse”, Fa 159/11-1,2,3).
Materials
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-ß-D arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24 well plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro tube (2 ml) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 ml) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 ml) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
References
- Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
- Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury. Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Dityatev, A., et al. Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets. Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).
- Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny. Front Neuroeng. 4, 1 (2011).
- Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons. J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).
- Geissler, M., Faissner, A. A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays. J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).
- Yu, C. Y., et al. Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis. Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).
- Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth. Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).
- Kucukdereli, H., et al. Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC. PNAS. 108, E440-E449 (2011).
- Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay. Synapse. 65, 41-53 (2011).
- Navarrete, M., Araque, A. Basal synaptic transmission: astrocytes rule!. Cell. 146, 675-677 (2011).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).
- Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets. Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Pyka, M., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).
- Eroglu, C. The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function. J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).
- Ethell, I. M., Ethell, D. W. Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).
- Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A., Dityatev, A. l. e. x. a. n. d. e. r., Wehrle-Haller, B. e. r. n. h. a. r. d., Asla, P. i. t. k. &. #. 2. 2. 8. ;. n. e. n. . Prog Brain Res. 214, 3-28 (2014).
- Dityatev, A., Rusakov, D. A. Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse. Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse. JoVe. , (2010).
