Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de<em> In Vitro</em> Profylactisch effect van interferonen
Summary
Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.
Abstract
Zika Virus (ZIKV) is een opkomende pathogeen die is gekoppeld aan foetale ontwikkelingsstoornissen afwijkingen zoals microcefalie, oogafwijkingen en verminderde groei. ZIKV is een RNA-virus van de familie Flaviviridae. ZIKV wordt voornamelijk overgedragen door muggen, maar kan ook worden verspreid door de moeder van de foetus verticale transmissie en seksueel contact. Tot op heden zijn er geen betrouwbare behandeling of vaccin keuzemogelijkheden bij besmet met het virus te beschermen. De ontwikkeling van een reproduceerbare effectieve Zika infectieus virus celkweeksysteem is cruciaal voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van ZIKV replicatie en geneesmiddel en vaccinontwikkeling. In dit opzicht is een protocol beschrijft een zoogdierlijke cellen gebaseerde in vitro Zika viruskweek voor virusproductie en groei analyse hier vermeld. Details betreffende de vorming van plaques door Zika virus op een cel monolaag en plaque-test voor het meten van virale titer worden gepresenteerd. Virale genoom replicatie kinetieken dubbelstrengs RNA genoom replicatory tussenproducten worden bepaald. Deze cultuur werd gebruikt om platform scherm tegen een bibliotheek van een kleine set van cytokinen resulteerde in identificatie van interferon-α (IFN-α), IFN-β en IFN-γ als krachtige remmers van virale groei Zika. Kortom, een in vitro infectieuze Zika viruskweek en div virologische assays worden aangetoond in deze studie, die in potentie de onderzoeksgemeenschap veel baat verder ophelderen van de mechanismen van virale pathogenese en de ontwikkeling van virale virulentie heeft. Antivirale IFN-alpha kan verder worden geëvalueerd als een profylactisch, na blootstelling profylactische en behandelingsoptie voor Zika virusinfecties in zeer riskante bevolking, met inbegrip van geïnfecteerde zwangere vrouwen.
Introduction
Zika Virus (ZIKV) is een belangrijke menselijke pathogeen geassocieerd met microcefalie en slechte zwangerschapsuitkomsten 1,4. ZIKV behoort tot de verzameling van medisch relevante flavivirussen die neurologische gebreken zoals Dengue, West Nile, en St. Louis encefalitis virussen kunnen veroorzaken. De belangrijkste wijze van virale transmissie van de mug vector Aedes aegypti, en bovendien heeft seksuele overdracht ook gemeld 5,6. ZIKV is uitgegroeid tot een grote wereldwijde gezondheidsprobleem als gevolg van de uitbreiding van de geografische spreiding van de mosquito vector en de sterke correlatie met aangeboren afwijkingen. ZIKV werd voor het eerst geïsoleerd in 1947 uit een sentinel rhesus aap in de Zika bos, Oeganda en de eerste menselijke geval werd gemeld in 1952 7,8. Personen die besmet raken met ZIKV aanwezig met milde symptomen zoals koorts, huiduitslag, hoofdpijn, conjunctivitis, en spier / gewrichtspijn geworden. Geïnfecteerde zwangere vrouwen kunnen ZIKV doorgeven aan de zich ontwikkelende foetus 1. ZIKV infectie is ook gekoppeld aan Guillain-Barre syndroom, een perifere zenuw auto-immune stoornis 9 demyelinisatie.
De Zika virale genoom bestaat uit een positieve sense, enkelstrengs RNA-molecuul dat ongeveer 10,8 kilobasen in lengte. De structuur van het genoom is georganiseerd als 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-2K-NS5-3'NCR, met niet-coderende regio (NCR) flankeren een eiwit coderend gebied 6. Een enkele polyproteïne (3419 aa) vertaald dat co- en post-translationeel gesplitst in 10 kleinere peptiden. Zowel de 5'NCR en 3'NCR RNA stam-lus structuren spelen een cruciale rol bij de aanvang van de virale genoom vertaling en replicatie. De structurele elementen van het genoom bestaan uit de capside, membraan en envelopeiwitten. De niet-structurele eiwitten zijn essentieel voor genoomreplicatie.
Op dit moment zijn Zika virusstammen gegroepeerd in drie genotypes: West-Afrikaanse, Oost-Afrikaanse en Aziatische 6,10-13. Het is voorgesteld dat de Oost-Afrikaanse afkomst verspreid naar West Afrika en Azië, waar later verder ontwikkeld 12. De Aziatische genotype is verantwoordelijk voor de huidige uitbraken in de Amerika's. Zika virus kan worden gekweekt in zowel mug en zoogdiercellen. Primaire dermale fibroblasten, ongerijpte dendritische cellen, corticale neurale progenitorcellen en Vero-cellen zijn gevoelig voor virale infectie Zika 10,14,15. Zowel type I als type II interferonen is aangetoond dat groei ZIKV in huidfibroblasten 15 beperken. De doelstellingen van deze studie zijn om een stapsgewijze gedetailleerde protocol voor de productie en het testen van de Aziatische genotype ZIKA virusstam PRVABC59 in een zoogdiercel kweeksysteem en om het nut van deze besmettelijke kweeksysteem als geneesmiddelenontwikkeling platform demonstreren. Deze bron heeft de potentie om veel baat de Zika virale en neurologisch onderzoek gemeenschap om i verder te ontrafelents mechanismen van virale pathogenese en ontwikkeling van virale virulentie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wordt een gestroomlijnde protocol voor het kweken Zika virus in vitro gepresenteerd. Kritische stappen met inbegrip van, het identificeren van optimale eindpunten voor de uitbreiding van het virus cultuur, het meten titer, en kwantificeren van genoom replicatie werden verstrekt. Zika virus is een menselijk pathogeen, dus, terwijl de behandeling van infectieuze middelen, bioveiligheid procedures moeten strikt worden opgevolgd. Een aap niercellijn, Vero, werd gebruikt voor het aantonen van verschillende viro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma Life Science | D5796 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red | Corning | 25-054-C1 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | T10282 | |
| Countess – Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
| Countess-cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10283 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System | Thermo Fischer | 4471088 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| Vero Cell Line | ATCC | CCL-81 | |
| Zika viral strain PRVABC59 | Centers for Disease Control and Prevention (CDC) | ||
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| IL-1 alpha | Peprotech | 200-01A | |
| TNF-alpha | Peprotech | 300-01A | |
| Interferon alpha A | R & D Systems | 11100-1 | |
| Interferon beta | Peprotech | 300-02BC | |
| Interferon gamma | Peprotech | 300-02 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 5415R | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810R | |
| Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI | Nikon | Visit Nikon for Request |
References
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro – Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
- Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), 59-62 (2015).
- Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).
- Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).
- Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).
- Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome–case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).
- Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).
- Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).
- Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).
- Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).
- Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).
- Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).
