Denne protokollen beskriver en ny metode for å dyrke og kvalitativt analysere bakterielle biofilmer på sopp-hyfer ved konfokal og elektronmikroskopi.
Bakterielle biofilmer ofte dannes på sopp overflater og kan være involvert i en rekke bakterielle soppsamhandlingsprosesser, for eksempel metabolsk samarbeid, konkurranse eller predasjon. Studiet av biofilm er viktig i mange biologiske felt, blant annet miljø, matproduksjon, og medisin. Imidlertid er det få studier fokusert på slike bakterielle biofilmer, delvis på grunn av vanskelighetene med å undersøke dem. De fleste av de fremgangsmåter for kvalitativt og kvantitativt biofilm analyser beskrevet i litteraturen, er bare egnet for biofilm forming på-biologiske overflater eller på homogene og tynne biotiske overflater, som et monolag av epitelceller.
Mens laser scanning konfokal mikroskopi (LSCM) blir ofte brukt for å analysere in situ og in vivo-biofilm, blir denne teknologien svært utfordrende når det påføres på bakterielle biofilmer på sopp hyfene, på grunn av tykkelsen og de tre dimensjonene til nettdekning hyphalOrks. For å overvinne denne mangel, har vi utviklet en protokoll som kombinerer mikroskopi med en metode for å begrense akkumuleringen av hyfene lag i soppkolonier. Ved hjelp av denne metoden, var vi i stand til å undersøke utviklingen av bakterielle biofilmer på soppens hyfer på flere skalaer som bruker både LSCM og scanning elektronmikroskopi (SEM). Denne rapporten beskriver protokollen, inkludert mikroorganisme kulturer, bakterielle biofilmdannelse forhold, biofilm flekker, og LSCM og SEM visualiseringer.
Sopp og bakterier har mange muligheter til å samhandle med hverandre fordi de samboere i de fleste terrestriske miljøer. På grunn av deres mangfold og deres ubiquity, disse interaksjonene er viktig i mange biologiske felt, blant annet bioteknologi, landbruk, matvareindustrien, og medisin 1, 2. Molekylære interaksjoner krever en viss grad av nærhet til tillate utveksling mellom partnerne, og i noen tilfeller er det nødvendig med fysisk sammenslutning av partnerne for en funksjonell samhandling tre. En vanlig fysisk assosiasjon mellom bakterier og sopp er dannelsen av bakterielle biofilmer på soppflatene 4. Denne direkte kontakt mellom bakterieceller og sopp hyfer tillater intime interaksjoner som er involvert i forskjellige biologiske prosesser. For eksempel i medisin, studiet av biofilmdannelse av Pseudomonas aeruginosa på mulighetunistic sopp patogen Candida albicans kan gi innsikt i sammenhengen mellom biofilmdannelse og virulens 5. I landbruket studier tyder på at plantevekstfremmende rhizobacteria og BIOCONTROL bakterier har en økt effektivitet når assosiert med en sopp i en blandet biofilm. For eksempel har Bradyrhizobium elkanii forbedret N2 -fixing aktivitet når de er knyttet til Pleurotus ostreatus i et blandet biofilm 6. Til slutt, i bioremediering, bakteriell-sopp blandede biofilmer har blitt brukt til utbedring av forurensede områder 7, 8.
LSCM er spesielt egnet for å studere biofilmer, siden det muliggjør en tredimensjonal observasjon av levende hydratisert biofilmer med minst forbehandlinger, for derved å opprettholde biofilm struktur og organisering. Dermed er biofilm analyse av LSCM veldig lærerikt, spesielt til Detrøyskatt tidsforløpet av biofilmdannelse og deteksjon av karakteristiske trinn 9, 10, fra adhesjonen trinn i utviklingen av en moden biofilm. Den er også særlig innrettet til å visualisere biofilm struktur og matrise 11, 12 eller for å kvantifisere størrelsen biofilmen 13, 14. Selv om denne metoden er egnet til å studere biofilm på abiotiske eller tynne biotiske overflater, studere bakteriell biofilm på en sopptrådformede koloni er fortsatt svært utfordrende. Faktisk, de fleste trådformede sopper bygge tykke, komplekse, tridimensional nettverk i kultur. Selv om tykke gjenstander kan avbildes ved konfokal mikroskopi, dempningen av laseren penetrasjon og fluorescensemisjonen ofte redusere kvaliteten av de endelige bilder over en dybde på 50 um 15. Dessuten, fordi soppkolonier ikke er stive, it er vanskelig å håndtere mikroorganismene uten å forstyrre biofilm. På grunn av tykkelsen av prøvene, blir de få mikroskopiske analyser av bakterielle biofilmer på sopp hyfer vanligvis bare utført på en liten del av soppkolonien, inneholdt derfor bare noen få hyfene 16, 17, 18. Alt dette begrenser muligheten for å beskrive biofilm fordeling på soppkolonien og dermed kan bringe skjevheter i analysen i tilfellet med heterogen fordeling av biofilmen i løpet av soppkoloni.
For å overvinne slike vanskeligheter, rapporterer en metode for vekst og analyse av bakteriell biofilm på sopp hyfer. Denne metoden ble brukt for å studere biofilmdannelse i Pseudomonas fluorescens BBc6 på hyfer av ectomycorrhizal basidiomycet Laccaria bicolor S238N. Disse to forest-jord mikroorganismer ble beskrevet tidligere for å danne blandedebiofilm-lignende strukturer 19, 20. Denne fremgangsmåten kan lett bli ytterligere tilpasses andre filamentøse sopp / bakterielle systemer. Metoden som presenteres her, er basert på kombinasjonen av en soppkultur-metoden, noe som muliggjør vekst av meget tynne soppkolonier, med LSCM og SEM avbildning. Dette tillater oss å få mikro- (mikrometer utvalg) og meso- (mm range) skalere utsikt over samspillet mellom de to mikroorganismer, slik at for kvalitativ karakterisering av biofilm. Vi viste også at prøvene kan observeres med SEM, tillater strukturanalyse av biofilm på nanoskala (nm).
Bakterielle biofilmer hentes i mange miljøer og er blitt studert siden 1950-tallet, som fører til utvikling av en rekke metoder for å analysere dem 24. Klassiske metoder for å kvantifisere og overvåke biofilm inkluderer mikro-titer analyser og, den mest brukte metoden, krystallfiolett (CV) farging. Disse metodene er rask, billig og lett å håndtere 25 og er spesielt nyttig for kvantifisering av total biofilm biomasse eller for å utføre levedyktighet og matrise kvantifisering analyser. På en annen side, "omics" metoder er også nyttige i biofilm studier, slik at for kvantitative og funksjonelle analyser av biofilmer 26, 27. Til tross for fordelene med mikro-titer plate og "omics" metoder, kan flere viktige funksjoner i biofilmer ikke fanges med disse teknikkene, hindrer en fullstendig forståelse av denne prosessen. Slike funksjoner inkluderer matrisestrukturs, bakterielle koloni arkitekturer, celle / celleinteraksjoner og kolonisering mønstre, som er viktige data for å forstå både funksjon av biofilm og dynamikken i deres dannelse. Til tross for kapasiteten til mikroskopi for å fange opp disse funksjonene, mikroskopi analyse av bakterielle biofilmer på trådformede sopp er fortsatt mangelvare. Dette er hovedsakelig på grunn av vekst av filamentøse sopp, som ofte danner kolonier av tykke, kompleks, tredimensjonalt nettverk. Dannelse av bakterielle biofilmer på sopp er vanlig i ulike miljøer og er betydelig involvert i ulike felt 4 (for eksempel medisin, landbruk og miljø.); derfor er det viktig å utvikle nye metoder for å lette deres undersøkelse. For å oppnå dette kombinert vi en fremgangsmåte for å generere svært tynne soppkolonier med mikroskopisk avbildning av de bakterielle biofilmer. I tillegg foreslo vi et sett med mikroskopi verktøy til kvalitativt analysere disse biofilm. Suksessen til metoden er avhengigevnen til å fremstille meget tynne hyphal kolonier og for å anvende de passende fargestoffer. Disse punktene er omtalt nedenfor.
På grunn av de komplekse strukturene i biofilmer, forstå deres funksjon krever en multi-skala tilnærming 28, 29. Distribusjon mønstre av biofilm, bakteriekoloni arkitektur, og matrise struktur og sammensetning er analysert på ulike skalaer (dvs. meso-skala og mikro-skala). Videre tillater nanoskala oppløsning tilgang til celle / celle fysiske interaksjoner og nano-struktur av matrisen. Således muliggjør den utviklede fremgangsmåten lett en multi-skala analyse av de bakterielle biofilmer dannet på soppkolonien.
I de fleste studiene, analyser LSCM av biofilm er begrenset til den mikroskala, meso-skala vanligvis blir utført ved hjelp av optisk koherens tomografi 30, 31, <supclass = "xref"> 32. Metoden som presenteres her muliggjør både mikro- og meso-skala analyser av LSCM. Det demonstrerer nytten av å kombinere både analyser i samme region av prøven og selv på det samme bildet ved hjelp av den nye generasjonen confocal mikroskoper med høy oppløsning (figur 3). Dermed spørsmål knyttet til samlet data samlet inn på ulike skalaer med forskjellige metoder er her unngås.
Denne kombinasjonen av analysene ga tilgang samtidig til biofilmen partisjonere på soppkolonien, den bakterielle koloni arkitekturen langs fremkallings biofilm, og det grunnmassestruktur. Meso-skala-analyse viste en heterogen fordeling av de bakterielle biofilmer på soppkolonier (figurene 2 og 3). Denne observasjonen ville ikke ha vært mulig med protokoller som bare tillater avbildning av en liten del av fungal koloni, som ikke nødvendigvis er representative for hele kolonien. Således, mensofte neglisjert, meso-skala analyse kan gi verdifull informasjon om biofilm distribusjonsmønstre.
Endelig kan den utviklede fremgangsmåten brukes til å analysere prøver med forskjellige mikroskopi teknikker, inkludert scanning elektronmikroskopi. Her SEM ble brukt for å nå nano-skala og for å få bakteriell romlige organiseringen i biofilm. Det utføres meget godt med de tynne soppkoloniene, mens SEM bare tillatt overflate imaging. I motsetning til LSCM, SEM, er imidlertid nødvendig prøven dehydrering og, som oftest, belegging med et ledende metall. Denne dehydrering prosessen kan endre biologiske strukturer når det ikke er riktig utført, og kan kreve optimalisering. Her ble prøven dehydrering ved hjelp av treg frysetørking brukt 33. Likevel vil anvende både LSCM og SEM til prøvene tillate utførelsen av korrelerende mikroskopi på samme sted av prøven.
Til tross for fordelenebeskrevet ovenfor, eksisterer noen begrensninger. For det første kan det ikke være aktuelt å sopp alle slag. Faktisk er denne dyrking metode utviklet for fungi sprer seg radialt på overflaten av faste medier. Denne metoden kan ikke være egnet for sopp som danner hovedsakelig lufthyfer (f.eks, Fusarium sp.) Eller for mikro-aerobisk fungi spredning hovedsakelig inne agar. Videre kan sopp nedverdigende cellofan være problematisk også (f.eks., Trichoderma sp.). For det andre er det viktig å merke seg at fargingen strategien er et kritisk punkt og valget av flekken må gjøres forsiktig, som flekken ikke må forstyrre den biofilm. For eksempel, la vi merke til at Calcofluor Hvit forårsaket delvis biofilm avbrudd (data ikke vist), sannsynligvis på grunn av den høye pH-verdien i denne flekken. Også noen fargestoffer produsert uensartet farging (f.eks., Congo Red), mens andre frem homogen farging (f.eks., Cellevegg farging med WGA-lektin), som gir et heterogent bildekvalitet.Videre er det viktig å være oppmerksom på at enkelte fargestoffer som ikke kan være fullt ut bestemt. For eksempel WGA flekker ikke bare soppens cellevegger, men også N-acetylneuraminsyre i gram-positive bakteriecellevegger og adhesinene produsert av gram-positive og -negative bakterier i løpet av biofilmdannelse 34, 35. Derfor bruker fluorescerende protein-merket bakterier og / eller sopp anbefales å unngå flere flekker. Hvis flere fargestoffer brukes, må de ikke er kjemisk forstyrre, og deres emisjonsspektra bør ikke overlapper hverandre.
Meso-skala-analyser krever en stor skannede området, og derfor kan LSCM være tidkrevende (40 min til 1 time, avhengig av prøvens tykkelse) og flaskehals analyse av et stort antall prøver. Ikke desto mindre, kan justeringer gjøres avhengig av hvilken type data som kreves. Det er mulig å redusere innhentingstiden og bildestørrelsen ved å endre bildekvaliteten. For eksempel, høyoppløseliger det ikke nødvendig å analysere biofilmen generelle partisjonere.
Endelig noen begrensninger må vurderes når du velger å vise Z- stabelen data som 2D eller 3D anslag. Todimensjonale anslagene er en god måte å oppsummere data, men dybde informasjon går tapt, og overlappende strukturer blir skjult. På den annen side, 3D-projeksjoner tillater visualisering fra ulike synsvinkler, men de ofte gjør det dårlig i tilfelle av romlig kompleksitet.
Som konklusjon, har vi rapportert en metode for karakterisering av bakterielle biofilmer på hyfene på det strukturelle nivå. Metoden kan utvides til andre applikasjoner. Faktisk, gir denne metoden ytelsen funksjonell eller kjemisk karakterisering av bakterielle biofilmer forming på sopp hyfer. På grunn av den store variasjonen av eksisterende fluorescerende reporter-systemer, kan brukes LSCM analyse for flere formål 29. For eksempel, fluorescensen microscopy kan brukes til å overvåke pH-gradient 36 eller molekyl diffusjon i biofilmer 37. I tillegg gir fremgangsmåten for samfunnet analyse i flerbestands biofilmer. For eksempel, fluorescens in situ hybridisering rettet mot spesifikke bakteriegrupper er spesielt nyttig for å studere bestemte bakterie partisjonere i flerbestands biofilmer 38, 39. Siste, mange fluorescerende fargestoffer kan anvendes for å karakterisere matrisen sammensetningen av biofilm 21. Her, proteiner ble rettet ved hjelp av Sypro, som flekker et stort utvalg av proteiner, blant dem matriksproteiner (figur 4), men også andre fargestoffer tillate visualisering av andre viktige matrise bestanddeler, slik som exopolysaccharides eller ekstracellulært DNA. Interessant, kan alle disse analysene utføres på meso-skala ved hjelp av den beskrevne metoden. Siden LSCM kan utføres på levende prøver,Det er også mulig å oppnå time-lapse avbildning ved hjelp av, for eksempel, coverwell kamre, spesielt egnet for tynne soppkolonier. Dette alternativet er spesielt interessant, da biofilmdannelse er en kompleks, dynamisk prosess. Til slutt, for en kvantitativ formål, kan den rapporterte metoden forbedre nøyaktigheten av automatiske kvantitativ analyse ved å gjøre denne kvantifisering mulig på meso-skala bilder. Dette kan overvinne biofilm heterogenitet og statistiske spørsmål 29.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the French National Research Agency through the Laboratory of Excellence ARBRE (ANR-11-LABX-0002-01), the Plant-Microbe Interfaces Scientific Focus Area in the Genomic Science Program, and the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. Oak Ridge National Laboratory is managed by UT-Battelle, LLC, for the United States Department of Energy under contract DE-AC05-00OR22725.
6 well Falcon Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 08-772-33 | Used in 2.2 & 3.1 |
Congo Red | Fisher Scientific | C580-25 | Used in 3.1.4.1 |
FUN 1 Cell Stain | Thermo Fisher Scientific | F7030 | Used in 3.1.4.1 |
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | Used in 3.1.4.1 |
DAPI solution | Thermo Fisher Scientific | 62248 | Used in 3.1.4.2 |
Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | Used in 3.1.4.3 |
FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix protein Stain | Thermo Fisher Scientific | F10318 | Used in 3.1.4.4 |
Fluoromount-G Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | Used in 3.1.7 |
LSM780 Axio Observer Z1 | Zeiss | Used in 3.2.1 | |
ZEN 2.1 lite black software | Zeiss | Used in 3.2.1 | |
High Vacuum Coater Leica EM ACE600 | Leica | Used in 4 | |
GeminiSEM-FEG | Zeiss | Used in 4 |