Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Summary

Bu protokol büyümek ve niteliksel konfokal ve elektron mikroskobu ile mantar hif bakteri biyofilm analiz etmek için yeni bir yöntem açıklanır.

Abstract

Bakteriyel biyofilm sık sık mantar yüzeylerde oluşturacak ve metabolik işbirliği, rekabet veya avlanma gibi çok sayıda bakteri-mantar etkileşim süreçleri, dahil edilebilir. biyofilm çalışma çevre bilimleri, gıda üretimi ve tıp gibi birçok biyolojik alanlarda önemlidir. Ancak az sayıda çalışma Kısmen onları soruşturma zorluğu, bu tür bakteriyel biyofilmlerin odaklanmıştır. literatürde tarif analizleri nitel ve nicel biyofilm yöntemlerin çoğu abiyotik yüzeyleri üzerinde ya da epitelyal hücrelerin tek bir tabakası homojen ince biyotik yüzeyler üzerinde oluşturan biyofilm için uygundur.

Lazer tarama konfokal mikroskopi (LSCM) sıklıkla in situ ve in vivo biyofilmlerinde analiz etmek için kullanılır iken hyphe'nin bakteri biyofilm uygulandığında, bu teknoloji sayesinde kalınlığı ve hifal şebkd üç boyutları, çok zor olurorks. Bu eksikliği gidermek için, biz mantar kolonileri içinde hifal katmanların birikimini sınırlamak için bir yöntem ile mikroskopi birleştiren bir protokol geliştirmiştir. Bu yöntemi kullanarak, biz de LSCM ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak birden fazla ölçeklerde hyphe'nin bakteriyel biyofilm gelişimini araştırmak için başardık. Bu rapor mikroorganizma kültürleri, bakteri biyofilm oluşumu koşulları, biyofilm boyama ve LSCM ve SEM görselleştirme dahil olmak üzere protokol açıklanmaktadır.

Introduction

Mantarlar ve bakteriler en çok karasal ortamlarda yaşayacakları çünkü birbirleri ile etkileşim için birçok fırsat var. Çeşitliliği ve bunların aynı anda her yerde nedeniyle, bu etkileşimler biyoteknoloji, tarım, gıda işleme ve tıp ^{1, 2} gibi birçok biyolojik alanlarda önemlidir. Moleküler etkileşimler ortaklar arasındaki alışverişi sağlamak yakınlığı belli bir derecede gerektirir ve bazı durumlarda, ortak bir fiziksel ilişki fonksiyonel etkileşim ³ için gereklidir. Bakteri ve mantar arasındaki ortak bir fiziksel ilişki mantar yüzeyleri ⁴ üzerinde bakteri biyofilmlerin oluşumudur. Bakteri hücreleri ve hyphe'nin arasındaki bu doğrudan temas, çeşitli biyolojik süreçlerde katılan samimi etkileşimleri izin verir. Örneğin, ilaç, Fırsatlar başarıyla Pseudomonas aeruginosa biyofilm çalışmadatunistic mantar patojen Candida albicans biyofilm oluşumu ve virülans ⁵ arasındaki bağlantı içgörüler sağlayabilir. Tarımda, çalışmalar karışık biyofilm bir mantar ile ilişkili o zaman bitki büyüme destekleyici Bu bakteriler ve biyo bakteriler bir verimlilik artışı olduğu ileri sürüldü. Karışık bir biyofilm ⁶ kavak mantarı ile birlikte, örneğin, Bradyrhizobium elkanii _N2 -fixing aktivitesi arttırmıştır. Son olarak, bio-temizlenmesi için, bakteri, mantar karışık biyofilm kirli sitelerinin ^{7 iyileştirme, 8} kullanılmıştır.

LSCM bu minimum ön işlemlerin ile sulu biyofilm oturma, böylece, biyofilm yapısını ve organizasyonunu korumanın bir üç boyutlu gözlem izin verdiği için biyofilm çalışma özellikle uygundur. Böylece, LSCM biyofilm analizi, özellikle det, çok bilgilendiriciolgun biyofilm gelişmesine yapıştırma aşamasından, biyofilm zaman sürecini ve karakteristik aşamaları ^{9, 10} saptanmasını ermin. Aynı zamanda, özellikle biyofilm yapısı ve matris ^{11, 12} görselleştirmek veya biyofilm boyutu ^{13, 14} ölçmek için adapte edilir. Bu yöntem, bir mantar ipliksi kolonisi bakteri biyofilm okuyan, abiyotik veya ince biyotik yüzeylerde biyofilm incelemek için uygun olmasına rağmen hala çok zordur. Gerçekten de, çoğu ipliksi mantarlar kültür kalın, karmaşık, üç boyutlu ağlar kurmak. Kalın nesneler konfokal mikroskobu ile görüntülü olabilir olsa bile, lazer penetrasyon zayıflama ve floresan emisyon genellikle 50 mikron ¹⁵ derinliğe üzerinde nihai görüntülerin kalitesini düşürür. Ayrıca, mantar kolonileri sert değildir çünkü, benT biyofilm bozmadan mikroorganizmaları ele almak zordur. Ancak örnekler kalınlığı, mantar hyphae'nin bakteri biyofilmlerin birkaç mikroskopik analizleri genellikle bu nedenle sadece az sayıda hif ^{16, 17, 18} ihtiva eden, mantar kolonisi küçük bir bölümü üzerinde gerçekleştirilir. Bütün bu mantar koloni içinde biyofilm heterojen dağılımı durumunda analiz içine önyargıları getirebilir ve böylece mantar kolonisi üzerinde biyofilm dağılımını açıklamak için yeteneğimizi sınırlar ve.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, büyüme ve mantar hyphae'nin bakteri biyofilm analizi için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem, Pseudomonas ectomycorrhizal basidiomiset grubu mantarın Laccaria bicolor S238N bölgesinin hifler üzerinde BBc6 fluorescens biyofilm oluşumunu çalışmak için uygulanmıştır. Bu iki orman-toprak mikroorganizmaları daha önce karma oluşturmak için tarif edilmiştirbiyofilm benzeri yapılar ^{19, 20.} Bu yöntem, kolaylıkla daha başka bir filamentli mantar / bakteri sistemlere adapte edilebilir. Burada sunulan yöntem LSCM ve SEM görüntüleme ile çok ince mantar kolonilerinin büyümesi sağlayan, bir mantar kültürü yöntemi kombinasyonuna dayanmaktadır. Bu biyofilm nitel karakterizasyonu için izin iki mikroorganizma arasındaki etkileşimin görüşlerini ölçek mikro (mikron aralığında) almak ve (mm aralığı) mezo bize izin verdi. Biz de numuneler nano ölçekli düzeyinde (nm aralığında) de biyofilm yapısal analizini izin, SEM ile görülebilir olduğunu gösterdi.

Protocol

Bakteriyel ve Fungal Kültürler 1. Hazırlık Mantar kültürleri hazırlanması Petri kapları ile aynı çapa sahip selofan membranlar hazırlayın ve 30 dakika boyunca EDTA (deiyonize su içinde 1 g / L) içinde kaynatın. deiyonize su ile yaprak durulayın ve iki kez otoklav. mantar agar aşılayarak bir mantar öncesi kültür hazırlayın EDTA önceden tedavi selofan membran ile kaplı uygun agar ortamı üzerinde takar. koloniler çapı yaklaşık 1 cm elde etmek için uygun bir büyüme sıcaklığında inkübe edin. L. bicolor S238N için + diNH4 tartrat 0.5 g KH 2 PO4 1 g, MgSO 4 0.5 g .7H 2, O, Maltoz D 5 g yapılan Pachlewski P5 agar ortamı üzerinde 5 gün boyunca 25 ° C'de inkübe , Glikoz D + 20 g,% 10 Tiamin-HCl 1 mi, 1 seyreltilmiş 1/10 mi mikro çözeltisi (6 g / L demir sülfat, 0.27 g / L molibden trioksit, 8.45 g / L, borik asit, 5 g / L adamganese sülfat; 5 g / L bakır sülfat; 2.27 g / l çinko sülfat), deiyonize su ile 1 L'ye yapılan; ve agar 20 g; pH 5.5. Mantar ön kültür kaynaktan, kolonilerin radyal genişlemesini desteklemek için düşük karbonlu bir agar ortamı içeren EDTA önceden muamele edilmiş selofan zar ile kaplı yeni agar plaka inoküle. Petri kabı aşılamak için, hafifçe bir neşter ile ön kültürden bir mantar kolonisi (hücreleri aynı fizyolojik durumu var) ve yeni agar plaka hif aktarmak dış alanı çizebilir. Yeni koloniler çapı yaklaşık 1 cm kadar optimum büyüme sıcaklığında inkübe edin. L. bicolor S238N için p20 agar ortamı (Dinh 4 tartrat, 0.25 g, 5 gün boyunca 25 ° C'de inkübe; KH 2 PO 4 0.5 g, MgSO 4 .7H 2 O 0.25 g glikoz D + 1 g % 10 Tiamin-HCl, 0.5 mi, 1/10 seyreltilmiş mikro çözeltisi (CF 1.1.2 0.5 mi.1), deiyonize su ile 1 L'ye yapılan; ve agar 20 g; pH 5.5). Not: nedeniyle selofan öncesi kültüre, ikinci kültür merkezi fişler agar ortamı içermez. Bu fişler agar ve analiz önyargıları oluşturabilir besin tanıtmak beri agar fişler, biyofilm daha fazla analiz için çıkarılmalıdır. Sadece mantar Bu aşaması, muhafaza ve agar plakaları üzerinde yayılır ve sporlar ya da donmuş stoktan yayılır mantarlar için gerekli değildir türlerin. Bakteri kültürlerinin hazırlanması (Kullanılan gerginlik bağlı olarak ya da herhangi bir başka uygun bir ortamda), sıvı Luria-Bertani (LB) ortamı içinde 25 ml uygun bir agar ortamı üzerine bir kültürden 2 ila 3 bireysel bakteriyel koloniler, toplamak ve aşılanması için steril bir döngü kullanın. P. BBc6 fluorescens için hafifçe çalkalanarak 28 ° C (~ 150 rpm) bir gecede kültürü kuluçkaya yatmaktadır. Not: soyunun kullanılmasımikroskobik gözlemler önce çift boyama (mantar ve bakteri) yerine getirilmesinin önüne geçen, çünkü GFP gibi floresan protein, ile etiketlenmiş, tercih edilir. Zamanlama, karıştırma hızı, ve kuluçkalama sıcaklığı kullanılan soyu geç üstel büyüme bir kültür elde etmek için olan hedef bağlıdır. Mantar Kolonisi Bakterilerin in vitro biyofilm N 2. Hazırlık Santrifüj bakteriyel 3 dakika boyunca 5000 x g'de kültürü ve steril 0.1 M potasyum fosfat tampon maddesi (25 g / L KH 2 PO 4 ve 2.78 g / l K 2 HPO 4, pH 5.8), 25 ml pelet askıya. Bir kere yineleyin ve aynı tamponla 10 9 hücre / ml nihai bakteri konsantrasyonu ayarlanır. Bakteriyel süspansiyon (veya negatif kontrol için, steril 0.1 M potasyum fosfat tamponu), 5 ml ile 6 mikroplakanın doldurun. Fung selofan membran kestiSteril bir jilet ile al kültürü her membran üzerinde tek bir mantar kolonisi ile selofan kareler elde etmek. Dikkatle forseps kullanılarak katı ortamdan hif ihtiva selofan kareler kaldırmak ve bakteriyel süspansiyonunu içeren mikroplaka bir kuyu selofan ihtiva hif kare aktarın. mantar kolonileri hala selofan bağlı iken yavaşça mikroplağı sallamak; Daha sonra, plaka fungal koloniler bırakarak, selofan sayfaları çıkarın. çalışılan mikroorganizmalar için uyarlanmış bir ısıda hafif bir çalkalama (~ 60 dak) mikroplaka inkübe edin. Not: inkübasyon süresi, analiz edilecek biyofilmin ve sahne oluşturulması hızına bağlıdır. P. BBc6 / L fluorescens. bicolor, erken evre biyofilm almak için 30 dakika boyunca 20 ° C'de inkübe edilmiş ve 16 st kadar biyofilm olgun alır. Biyofilm Format 3. Lazer Tarama Konfokal Mikroskop Analiziiyon örnek hazırlama Güçlü bir tuz çözeltisi (NaCI, 17 g / L) 17, 5 ml ile dolu yeni bir 6-çukurlu mikro-aktararak mantar durulama hif elektrostatik bağlı planktonik bakterilerin ve bakteri kaldırmak için; nazikçe 1 dakika sallayın. yavaşça, 2 dakika için sallayın, steril 0.1 M potasyum fosfat tampon maddesi 5 ml ihtiva eden yeni bir 6-yuvalı mikroplakaya mantar transfer ve taze potasyum fosfat tamponuna mantar aktarın. Elde edilen bölüm, mantar kolonisi yaklaşık yarısını içerecek şekilde, potasyum fosfat tamponu içinde tutarken mantar kolonisi kısmı kesilmiş bir neşter ile görüntülenmek üzere. örnek leke için, uygun bir floresan boya (analizin amacı ile ilgili olarak) ihtiva eden steril su ile dolu bir Petri kabı transfer ve karanlıkta inkübe edilir. Mantar ağ görselleştirmek için, örneğin, kullanımı, Kongo Kırmızı (% 0.1 nihai eşncentration, inkübasyondan 5 dakika) ve Alexa Fluor 633 (10 ug / ml nihai konsantrasyonda konjüge, buğday tohumu agglutin (WGA) lektin, inkübasyon 10 dakika) ya da FUN1 (10 uM son konsantrasyon, kuluçkalama 10 dakika). ticari olarak temin edilebilir bir çok hücreye nüfuz edici DNA, boyalar arasında bir DNA özgü flüoresan sonda ile bakteri hücreleri Counterstain olmayan bir floresan etiketli bakteri kullanarak. Örneğin, DAPI (0.25 ug / ml nihai konsantrasyon, kuluçkalama 10 dakika) kullanın. Matris proteinleri görselleştirmek için, bir protein leke 21 kullanın. Boyamadan sonra, steril 0.1 M potasyum fosfat, 10 ml ihtiva eden bir Petri kabı kapağı aktararak örnek yıkayın ve hafifçe 1 dakika çalkalayın. Yarım Petri kabı kapağı bir slayt batığın ve ince slayt üzerinde yüzer kesim bölümü getirmek. Sonra, yavaş yavaş numune nazikçe slayt üzerinde yerleşmek için izin tampon çözeltisinden slayt kaldırmak. <br /> Not: Bu adım için, bu biyofilm rahatsızlık önlemek için yavaşça devam etmek çok önemlidir. Son olarak, numune, anti-solma montaj orta 10 ul bir cam lamel ile örtün. Not: slayt hazırlandıktan sonra, mikroskobik analiz kısa sürede yapılmalıdır (en fazla 30 dakika içinde) biyofilm yapısı değişiklik önlemek için. Konfokal mikroskopik analiz görüntüleme yazılımı bağlanmış bir 10X veya 40X objektif lens ile konfokal lazer mikroskop altında slaytlar inceleyin. Not: Burada, bir çoklu ışın tarama konfokal mikroskop 405, 488, ve 561 nm eksitasyon lazerler, bir Gaasp PMT detektörü ve 10X 0.3 NA ve 40X 1.2 NA hedefleri ile donatılmış kullanılmıştır. Talep edilen veri tipine ve zaman kısıtlar uyarlanmış parametreleri kullanılarak görüntüleme gerçekleştirin. kullanılan leke ve üreticinin recommendati göre lazer uyarma / emisyon dalga boylarında kullanınons. mantar kolonisi ve biyofilm küresel 3D görüşlerini almak için kiremit tarama ve Z-yığın fonksiyonları bir arada kullanın. Not: Şekil 3 Görüntüler aşağıdaki parametreleri kullanılarak elde edildi: 8-bit / piksel, ortalama = 2 = 1.58 mikro-sn, fayans çevrimiçi dikiş (% 10 kapsama, eşik = 0.7) ile 5×5 görüntüleri taramak piksel bekleme; Z adımlı = 2 um. 3D veri görselleştirme için birçok ücretsiz veya ticari yazılımlarla (bu 3D rendering için birçok seçenek sunan) birini kullanın. Örneğin, parlak alan kanalını çıkarma, 2D maksimum yoğunluğu projeksiyonları olarak Z-yığın verilerini görüntülemek parlaklık ve kontrast ayarı ve kompozit bir görüntü oluşturmak için kanalları birleştirmek. Varsa, Z-yığın ekstremitelerde sinyali olmadan dilimleri ortadan kaldırır. Sonra, bir 2D maksimum yoğunluk projeksiyonu gerçekleştirmek ve RGB renk içine sonucu dönüştürmek. Görüntüler s elde etmek için ImageJ yazılım 22 "Z projesi" işlevini kullanın2B maksimum yoğunluğu projeksiyonları burada tepkiyle karşılanmıştır. 4. Elektron Mikroskobu Analizi Adım 3.1.2 hariç, LSCM için tarif edildiği gibi örnekleri hazırlamak durulama adımlarından sonra steril su yerine potasyum fosfat tamponu ile biyofilm aktarın. Bu SEM görüntü alma karıştırmayı olur dehidratasyon adımı sırasında tuz kristallerinin oluşumunu önler. Bir örnek sahibine biyofilm aktarın ve aşırı su çıkarmak; Sadece örnek karşılamak için küçük bir su film tabakası sağlar. değişken basınç taramalı elektron mikroskobu (VP-SEM) odasına örnek aktarın; Bir Peltier soğutma sahnede ° C -50 dondurma; ve yavaş dondurma-kurutma için, doğrudan SEM odası içinde, 15 saat süre ile belirlenen değişken basınç 100 Pa ile sağlar. Dondurarak kurutma işlemi tamamlandıktan sonra, numune almak ve yüksek vakumlu film kaplama sistemi içine aktarın. Platinu 2 nm ile kaplayın örnekm argon plazmanın (2.5 x 10 -2 mbar, 35 mA) altında (kuvars ölçümü). yüksek "lens" çözünürlüğü dedektörü ve 1 kV elektronik yüksek gerilim kullanarak bir alan emisyon tabanca (FEG) ile donatılmış bir SEM ile kaplanmış örnek gözlemleyin.

Representative Results

Fungal kültür ve biyofilm hazırlık genel şematik prosedürü, Şekil 1 'de verilmiştir. Kültür yöntemi bize kalın mikro ve mezo ölçekli izin hif birkaç katman içeren 20 ila 50 mikron LSCM kullanarak sulandırılmış yaşam biyofilm analizleri mantar koloniler elde etmek için izin verdi. Yöntemin uygulama P. yüksek kaliteli görüntülerin elde edilmesi biyofilm (- 4 Şekil 2) oluşumu boyunca L. bicolor hifler üzerinde BBc6 biyofilm fluorescens izin verdi. Biyofilm mezo ölçekli analizi P. biyofilm heterojen dağılımı L. bicolor S238N ve hif (Şekil 2 ve 3) üzerine BBc6 fluorescens gösterdi. Mezo-ölçekli analizi de zamanla biyofilm oluşumunun takibi (Şekil izin3) Sadece bazı bakteri hifler (Şekil 3a bağlı edildiği erken safhalarında) ile ilgili), kalın, olgun bir biyofilm (Şekil 3b oluşumuna. Mezo ölçekli görüntüleri yüksek çözünürlüklü bizi koloni mimarileri (- d Şekil 3c) elde etmek amacıyla aynı görüntülerde mikro ölçekli analizi gerçekleştirmek için izin verdi. Belirli etiketleme ile kombine mikro ölçekli analiz biyofilm karakterizasyonu bir adım daha ileri gitmek sağladı. Burada, proteinlerin çoğu sınıfları etiketler SYPRO Ruby 23, numune (Şekil 4) uygulanır ve matriks proteinlerinin mevcudiyetini göstermektedir edildi. Son olarak, biyofilm yapısının daha detaylı bilgi için dehidrasyon ve kaplamanın (Şekil 5) sonra aynı numune SEM görüntüleme ile elde edilmiştir. SEM görüntüleme Resimnanoölçekli seviyesine erişim, böylece matris yapısına erişim sağlayarak. Şekil 1: mantar kültürü ve biyofilm hazırlık Genel şematik prosedür. Bu rakam analizleri örnek mikroorganizma kültürleri, yöntemin temel adımları açıklar. Daha fazla detay protokolde verilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2: mantar kolonisi üzerinde BBc6 biyofilm yeniden bölme. Numune 10X büyütmede etkileşim 18 saat sonra görüntülendi. Görüntü 3D konfokal mikroskopi görüntüleri 2D maksimum intensite projeksiyon yoluyla elde edilmiştir. figu gri ızgaraYeniden mozaik pozisyonları göstermektedir. L. bicolor hifler Kongo Kırmızısı (kırmızı) ve bakteri ile GFP etiketli (yeşil) vardır boyandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3: L. bicolor hifler üzerinde BBc6 biyofilm oluşumunun erken ve geç evreleri. Bu görüntü 3D konfokal mikroskopi görüntüleri 2D maksimum intensite projeksiyon yoluyla elde edilmiştir. Görüntüleme 40X büyütmede yapılmıştır. (A) etkileşim 2 saat sonra yeniden bölmek biyofilm. Etkileşim 14 saat sonra (b) Biyofilm yeniden bölme. (C), beyaz bir dikdörtgen genişleme (a) dır. (D) 'de beyaz bir dikdörtgenin Büyütme (B). GFP-ta mantar hyphae'nin Kongo Kırmızısı (kırmızı) ve bakteriler ile boyanır olangged (yeşil). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 4: L. bicolor hifler üzerinde BBc6 biyofilm Matris boyama. (A) etkileşim 16 saat sonra Biyofilmlererde. (B) de beyaz bir dikdörtgenin Büyütme (a) dır. Görüntüleme 40X büyütmede yapılmıştır ve bu görüntülerin 3D konfokal mikroskopi görüntü 2D maksimum yoğunluk projeksiyon ile elde edildi. Bakteri GFP etiketli (yeşil), mantar FUN1 (koyu yeşil) ile boyandı, ve proteinler S. Ruby (kırmızı) ile boyandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <p class= Fo "jove_content": keep-together.within-page = "1"> Şekil 5: L. bicolor hifler üzerinde BBc6 biyofilm SEM görüntüleme. SEM görüntü alma EHT, 2360X gerçekleştirildi: 1kV. görüntüleme önce, numune yavaşça SEM bölmesine dondurarak kurutuldu ve platin kaplanmış. Yeşil oklar bakteriyel biyofilmlerin işaret ve sarı oklar hyphe'nin işaret etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Bacterial biofilms are retrieved in many environments and have been studied since the 1950s, leading to the development of a number of methods to analyze them²⁴. Classical methods to quantify and monitor biofilms include micro-titer assays and, the most widely-used method, crystal violet (CV) staining. These methods are fast, low cost, and easy to handle²⁵ and are particularly useful to quantify total biofilm biomass or to perform viability and matrix quantification assays. On an other hand, "omics" methods are also useful in biofilm studies, allowing for quantitative and functional analyses of biofilms^26,27. Despite the advantages of micro-titer plate and "omics" methods, several essential features of biofilms cannot be captured with these techniques, hindering a complete understanding of this process. Such features include matrix structures, bacterial colony architectures, cell/cell interactions, and colonization patterns, which are key data for understanding both the functioning of biofilms and the dynamics of their formation. Despite the capacity of microscopy to capture these features, microscopy analysis of bacterial biofilms on filamentous fungi are still scarce. This is mainly due to the growth of filamentous fungi, which often forms colonies of thick, complex, tridimensional networks. Formation of bacterial biofilms on fungi is common in diverse environments and is significantly involved in various fields⁴ (e.g., medicine, agriculture, and environment); hence, it is critical to develop new methods to facilitate their investigation. To this end, we combined a method to generate very thin fungal colonies with microscopic imaging of the bacterial biofilms. In addition, we proposed a set of microscopy tools to qualitatively analyze those biofilms. The success of the method relies upon the ability to produce very thin hyphal colonies and to apply the appropriate dyes. These points are discussed below.

Due to the complex structures of the biofilms, understanding their function requires a multi-scale approach^28,29. Distribution patterns of the biofilms, bacterial colony architecture, and matrix structure and composition are analyzed at different scales (i.e., meso-scale and micro-scale). Moreover, nanoscale resolution allows access to the cell/cell physical interactions and the nano-structure of the matrix. Thus, the developed method easily enables a multi-scale analysis of the bacterial biofilms formed on the fungal colony.

In most studies, LSCM analyses of biofilms are limited to the micro-scale, the meso-scale usually being performed by optical coherence tomography^30,31,32. The method presented here enables both micro- and meso-scale analyses by LSCM. It demonstrates the utility of combining both analyses in the same region of the sample and even on the same image using new-generation confocal microscopes with high resolution (Figure 3). Thus, issues linked to compiled data gathered at different scales with different methods are here avoided.

This combination of analyses gave access concomitantly to the biofilm repartition on the fungal colony, the bacterial colony architecture along the developing biofilm, and the matrix structure. The meso-scale analysis showed a heterogenic distribution of the bacterial biofilms on the fungal colonies (Figures 2 and 3). This observation would not have been possible with protocols that only permit imaging of a small portion of the fungal colony, which is not necessarily representative of the entire colony. Thus, while often neglected, the meso-scale analysis can give precious information about biofilm distribution patterns.

Finally, the developed method can be used to analyze samples with different microscopy techniques, including scanning electron microscopy. Here, SEM was used to reach the nano-scale and to obtain the bacterial spatial organization within the biofilm. It performed very well with the thin fungal colonies, while SEM only permitted surface imaging. In contrast to LSCM, SEM, however, required sample dehydration and, most often, coating with a conductive metal. This dehydration process might alter biological structures when it is not properly executed and may require optimization. Here, sample dehydration using slow lyophilization was used³³. Nevertheless, applying both LSCM and SEM to the samples will allow the performance of correlative microscopy at the same location of the sample.

Despite the advantages described above, some limitations exist. Firstly, it may not be applicable to all kind of fungi. Indeed, this culturing method is developed for fungi spreading radially on the surface of solid media. This method may not be suitable for fungi forming mainly aerial hyphae (e.g., Fusarium sp.) or for micro-aerobic fungi spreading mainly inside agar. Moreover, fungi degrading cellophane may be problematic as well (e.g., Trichoderma sp.). Secondly, it is important to note that the staining strategy is a critical point and the choice of the stain must be made carefully, as the stain must not disturb the biofilm. For example, we noticed that Calcofluor White caused partial biofilm disruption (data not shown), likely due to the high pH of this stain. Also, some dyes produced heterogeneous staining (e.g., Congo Red), while others produced homogeneous staining (e.g., cell wall staining with WGA lectin), giving a heterogeneous image quality. Moreover, it is important to be aware that some dyes might not be fully specific. For example, WGA stains not only fungal cell walls but also N-acetylneuraminic acid in gram-positive bacterial cell walls and adhesins produced by gram-positive and -negative bacteria during biofilm formation^34,35. Therefore, using fluorescent protein-tagged bacteria and/or fungi is recommended to avoid multiple staining. If multiple dyes are used, they must not chemically interfere, and their emission spectra should not overlap.

Meso-scale analyses require a large scanned area, and therefore, LSCM may be time-consuming (40 min to 1 hr, depending on the sample thickness) and bottleneck the analysis of a large number of samples. Nonetheless, adjustments can be made depending on the type of data required. It is possible to decrease acquisition time and image size by altering the image quality. For example, high resolution is not necessary to analyze the biofilm general repartition.

Finally, some limitations need to be considered when choosing to display Z- stack data as 2D or 3D projections. Two-dimensional projections are a good way to summarize data, but depth information is lost, and overlapped structures become hidden. On the other hand, 3D projections allow the visualization from different points of view, but they often render poorly in case of spatial complexity.

In conclusion, we have reported a method for the characterization of bacterial biofilms on hyphae at the structural level. The methodology can be extended to other applications. Indeed, this method allows the performance of functional or chemical characterization of bacterial biofilms forming on fungal hyphae. Due to the great variety of existing fluorescent reporter systems, LSCM analysis can be used for multiple purposes²⁹. For example, the fluorescence microscopy could be used to monitor pH gradient³⁶ or molecule diffusion in biofilms³⁷. Additionally, the method allows for community analysis in multispecies biofilms. For example, fluorescence in situ hybridization targeting specific bacterial groups is particularly useful to study specific bacterial repartition in multispecies biofilms^38,39. Last, numerous fluorescent dyes can be used to characterize the matrix composition of the biofilms²¹. Here, proteins were targeted using Sypro, which stains a large range of proteins, among them matrix proteins (Figure 4), but other dyes allow for the visualization of other important matrix constituents, such as exopolysaccharides or extracellular DNA. Interestingly, all these analyses could be performed at the meso-scale using the described method. Since LSCM can be performed on living samples, it is also possible to achieve time-lapse imaging using, for example, coverwell chambers, particularly suitable for thin fungal colonies. This option is particularly interesting, as biofilm formation is a complex, dynamic process. Finally, for a quantitative purpose, the reported method may improve the accuracy of automatic quantitative analysis by making this quantification possible on meso-scale images. This may overcome biofilm heterogeneity and statistical issues²⁹.

Materials

6 well Falcon Tissue Culture Plates	Fisher Scientific	08-772-33	Used in 2.2 & 3.1
Congo Red	Fisher Scientific	C580-25	Used in 3.1.4.1
FUN 1 Cell Stain	Thermo Fisher Scientific	F7030	Used in 3.1.4.1
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	W21404	Used in 3.1.4.1
DAPI solution	Thermo Fisher Scientific	62248	Used in 3.1.4.2
Propidium iodide	Thermo Fisher Scientific	P3566	Used in 3.1.4.3
FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix protein Stain	Thermo Fisher Scientific	F10318	Used in 3.1.4.4
Fluoromount-G Slide Mounting Medium	Fisher Scientific	OB100-01	Used in 3.1.7
LSM780 Axio Observer Z1	Zeiss		Used in 3.2.1
ZEN 2.1 lite black software	Zeiss		Used in 3.2.1
High Vacuum Coater Leica EM ACE600	Leica		Used in 4
GeminiSEM-FEG	Zeiss		Used in 4