Vorbereitung und<em> In Vitro</em> Charakterisierung der für Magnetresonanz-Kontrastmittel Dendrimer-basierten
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Charakterisierung eines dendrimeren Magnetresonanztomographie (MRI), die Kontrastmittel trägt cyclen basierenden makrocyclischen Chelate paramagnetischen Ionen Gadolinium- koordinieren. In einer Reihe von MRI – Experimente in vitro produzierte dieses Mittel ein verstärktes MRI – Signal , wenn an dem handelsüblichen monomeren Analogon verglichen.
Abstract
Paramagnetische Komplexe von Gadolinium (III) mit acyclischen oder makrocyclischen Chelate sind die am häufigsten verwendeten Kontrastmittel (CAs) für die Magnetresonanztomographie (MRI). Ihr Zweck ist es, die Relaxationsrate von Wasserprotonen in Gewebe zu verbessern, wodurch die MR Bildkontrast und die Spezifität der MRI-Messungen. Strom klinisch zugelassenen Kontrastmittel sind niedermolekulare Moleküle, die vom Körper rasch gelöscht werden. Die Verwendung von Dendrimere als Träger von paramagnetischem Chelatoren kann eine wichtige Rolle bei der zukünftigen Entwicklung von effizienteren MRI-Kontrastmittel spielen. Insbesondere die Erhöhung der lokalen Konzentration der paramagnetischen Spezies führt zu einem höheren Signalkontrast. Darüber hinaus liefert diese CA eine längere Geweberetentionszeit aufgrund seines hohen Molekulargewicht und -größe. Hier zeigen wir, ein praktikables Verfahren zur Herstellung von hochmolekularen MRI-Kontrastmittel auf Basis von Poly (amidoamin) (PAMAM) Dendrimere mit monomacrozyklischen DOTA-Typ Chelatoren (DOTA – 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraacetate). Die chelatbildende Einheit wurde durch Ausnutzen der Reaktivität des Isothiocyanat (NCS) Gruppe in Richtung der Aminoberflächengruppen des PAMAM Dendrimer beigefügten Thioharnstoff Brücken zu bilden. Dendrimeren Produkte wurden mittels Kernresonanzspektroskopie, Massenspektrometrie gereinigt und analysiert, und die Elementaranalyse. Schließlich wurden hochaufgelöste MR-Bilder aufgenommen und die Signal Kontraste aus dem vorbereiteten dendrimeren und den im Handel erhältlichen monomeren Mittel verglichen wurden erhalten.
Introduction
Die Magnetresonanztomographie (MRT) ist ein leistungsfähiges und nichtionisierende Bildgebungstechnik weit verbreitet in der biomedizinischen Forschung und der klinischen Diagnostik aufgrund seiner nicht-invasiven Natur und ausgezeichnete Eigenweichteilkontrast. Die am häufigsten verwendeten MRI Verfahren verwenden das Signal von Wasserprotonen erhalten wird, Bilder mit hoher Auflösung und die Bereitstellung detaillierter Informationen innerhalb der von Unterschieden in der Dichte der Wassersignale basierend Geweben. Die Signalintensität und die Spezifität der MRI-Experimente weiter verbessert werden kann unter Verwendung von Kontrastmitteln (CAs). Diese sind paramagnetische oder super Spezies , die die longitudinale (T 1) und Querrichtung (T 2) Relaxationszeiten beeinflussen bzw. 1,2.
Komplexe der Lanthanid – Ion Gadolinium mit Polyaminogruppen Polycarbonsäure Liganden sind die am häufigsten verwendeten T 1 CAs. Gadolinium (III) verkürzt die T 1 EntspannungsZeit von Wasserprotonen zu erhöhen, so dass die Signalkontrast in der MRT – Experimente 3. Jedoch ionische Gadolinium ist giftig; dessen Größe etwa derjenigen von Calcium (II), und es wirkt sich stark Calcium-assisted in Zellen signalisieren. Daher Chelate azyklisch und makrocyclischen werden verwendet, um diese Toxizität zu neutralisieren. Verschiedene mehrzähnigen Liganden wurden bisher 1, was zu Gadolinium (III) -Komplexe mit hoher thermodynamischer Stabilität und kinetische Inertheit entwickelt. Diejenigen, auf der Basis der 12-glied azamacrocycle cyclen, insbesondere seine Tetra Derivat DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraacetate) sind die am besten untersuchten und angewandte Komplexe dieser CA-Klasse.
Dennoch GdDOTA-Typ CAs sind niedermolekulare Systeme und zeigt gewisse Nachteile wie geringe Kontrast Effizienz und schnelle renale Ausscheidung. Makromolekulare und mehrwertige CAs kann eine gute Lösung für diese Probleme 4 sein. Da CA biodistribution wird vor allem durch ihre Größe bestimmt, hochmolekularen CAs Anzeige viel längere Retentionszeiten innerhalb von Geweben. Ebenso wichtig ist , die Multivalenz dieser Mittel führt zu einer erhöhten lokalen Konzentration des monomeren MR – Sonde (beispielsweise GdDOTA complex), im wesentlichen den erfassten MR – Signals und die Messqualität zu verbessern.
Dendrimere sind unter den am meisten bevorzugten Gerüste für die Herstellung von mehrwertigen CAs für MRI 4,5. Diese hochverzweigten Makromoleküle mit definierter Größen sind anfällig für verschiedene Kopplungsreaktionen auf ihrer Oberfläche. In dieser Arbeit berichten wir über die Herstellung, Reinigung und Charakterisierung eines dendrimeren CA für die MRT, bestehend aus einer Generation 4 (G4) Poly (Amidoamin) (PAMAM) Dendrimer gekoppelt GdDOTA artigen Chelate (DCA). Wir beschreiben die Synthese des reaktiven DOTA-Derivat und dessen Kopplung an das PAMAM-Dendrimer. Folge der Komplexbildung mit Gd (III), die Standard-physikochemische Charakterisierung procedure von DCA durchgeführt wurde. Schließlich wurden MRI-Experimente ausgeführt, um die Fähigkeit von DCA zu erzeugen MR-Bilder mit einem stärkeren Kontrast als die von niedermolekularen CAs erhalten zu demonstrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Herstellung der dendrimeren MRI Kontrastmittels erfordert eine geeignete Auswahl der monomeren Einheit (dh der Chelator für Gd (III)). Sie reduzieren die Toxizität dieses paramagnetischen Ion und bis heute eine große Auswahl an azyklisch und makrocyclischen Chelatbildnern diesem Zweck dienen 1-3. Unter diesen makrocyclischen DOTA-Typ – Chelatoren besitzen die höchste Stabilität thermodynamischen und kinetischen Inertheit und damit sind die bevorzugte Wahl zur Herstellung von inerten MRI – Kontra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The financial support of the Max-Planck Society, the Turkish Ministry of National Education (PhD fellowship to S. G.), and the German Exchange Academic Service (DAAD, PhD fellowship to T. S.) are gratefully acknowledged.
Materials
| Cyclen | CheMatech | C002 | |
| tert-Butyl bromoacetate | Alfa Aesar | A14917 | |
| N,N-Dimethylformamide | Fluka | 40248 | |
| Potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| 4-(4-Nitrophenyl)butryic acid | Aldrich | 335339 | |
| Thionyl chloride | Acros Organics | 382662500 | Note: Corrosive substance; toxic if inhaled |
| Bromine | Acros Organics | 402841000 | Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled |
| Diethyl ether | any source | ||
| Sodium sulphate | Acros Organics | 196640010 | |
| Chloroform | VWR Chemicals | 22711.29 | |
| tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate | Aldrich | 364789 | Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes |
| Boron trifluoride etherate | Acros Organics | 174560250 | 48 % BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 424270010 | |
| Ethyl-acetate | any source | For column chromatography | |
| n-Hexane | any source | For column chromatography | |
| Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus | Büchi | Model type: Glass oven B-585 | |
| Silicagel | Carl Roth GmbH | P090.2 | |
| Methanol | any source | For column chromatography | |
| Dichloromethane | any source | For column chromatography | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| Ammonia | Acros Organics | 428381000 | 7N Solution in Methanol |
| Palladium | Aldrich | 643181 | 15 % wet |
| Hydrogenation apparatus PARR | PARR Instrument Company | ||
| Celite 503 | Aldrich | 22151 | |
| Sintered glass funnel | any source | ||
| Thiophosgen | Aldrich | 115150 | Note: irritrant to skin; toxic if inhaled |
| Triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| Dichloromethane | Acros Organics | 348460010 | Extra dry |
| Magnetic stirrer | any source | ||
| PAMAM G4 Dendrimer | Andrews ChemService | AuCS – 297 | 10 % wt. solution in MeOH |
| Lipophylic Sephadex LH-20 | Sigma | LH20100 | |
| Thin-layer chromatography plates | Merck Millipore | 1.05554.0001 | |
| Formic acid | VWR Chemicals | 20318.297 | |
| Lophylizer | any source | ||
| Gadollinium(III) chloride hexahydrate | Aldrich | G7532 | |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 134070010 | |
| pH meter | any source | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Aldrich | E5134 | |
| Mass spectrometer (ESI) | Agilent | Ion trap SL 1100 | |
| Acetate buffer | any source | pH 5.8 | |
| Xylenol orange | Aldrich | 52097 | 20 μM in acetate buffer |
| Hydrophylic Sephadex G-15 | GE Healthcare | 17-0020-01 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore | UFC900324 | Ultracel-3 membrane (MWCO 3000) |
| Centrifuge | any source | ||
| NMR spectrometer | Bruker | Avance III 300 MHz | |
| Topspin | Bruker | version 2.1 | |
| Combustion analysis instrument | EuroVector SpA | EuroEA 3000 Elemental Analyser | |
| MALDI-ToF MS instrument | Applied Biosystems | Voyager-STR | |
| Deuteriumoxid | Carl Roth GmbH | 6672.3 | |
| tert-Butyl alcohol | Carl Roth GmbH | AE16.1 | |
| Vortex mixer | any source | ||
| Norell NMR tubes | Deutero GmbH | 507-HP-7 | |
| NMR coaxial tube | Deutero GmbH | coaxialb-5-7 | |
| DLS instrument | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| 0.20 μm PTFE filter | Carl Roth GmbH | KC94.1 | |
| HEPES | Fisher BioReagents | BP310 | |
| Plastic tube vials | any source | ||
| Dotarem | Guerbet | NDC 67684-2000-1 | |
| MRI scanner | Bruker | BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields | |
| RF coil | Bruker | dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR) | |
| Paravision (software) | Bruker | Version 5.1 |
References
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