Isolasjon og Culture of Primary endotelceller fra Canine arterier og vener
Summary
Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.
Abstract
Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.
Introduction
Hunder anvendt som stort dyremodell for kardiovaskulær sykdom forskning og kan også lider av medfødt (genetiske) karlidelser 1, 2. For å studere disse sykdommene kommersielle endotel-cellelinjer blir ofte brukt til å vurdere endotelceller (EC) funksjonalitet. For hunder det er en kommersiell endotelial cellelinje tilgjengelig (CnAOEC), avledet fra canine aorta. Denne cellelinje er for det meste brukt i studier som kontroll normal ECS 3-5. I menneskelige hjerte-forskning de mest brukte endothelial cellelinjer er menneskelig navleveneendotel Cells (HUVECs) og menneskelig Umbilical Artery endotelceller (HUAECs) stammer fra menneskelige navlestreng venen og arterien, henholdsvis. HUVECs har blitt brukt som gullstandard i vaskulær forskning siden 1980-tallet seks. De er ansett for å være den klassiske modellsystem for å studere endotelial funksjon og sykdom tilpasning. Endotelceller isolert fra forskjellige blodkar varierer i appearance og funksjonalitet på grunn av genetisk bakgrunn og eksponering for mikromiljøet 7. I tillegg er HUVECs og HUAECs avledet fra navlestreng, en utviklings vaskulær struktur som kanskje ikke fullt ut etterligne voksen blodkar med hensyn til forholdene de blir utsatt for og respons på sykdom. Derfor sette resultater funnet i HUVECs og HUAECs til hjerte- og karsykdommer generelt er utilstrekkelig.
Når man studerer tilpasning og opptreden av voksen ECS, bør primære ECS fra fartøyet av interesse bli brukt som en mer direkte tilnærming. For å isolere disse cellene, har flere metoder blitt rapportert. Et vidt beskrevne fremgangsmåte, som også brukes til HUVECs, tømmes beholderen med en enzymatisk fordøyelse løsning 8. Dette resulterer ofte i forurensning med ikke-ECS slik som glattmuskelceller og fibroblaster 9. En annen hyppig brukt metode for isolasjon er enzymatisk fordøyelse av kvernet fartøyet vev etterfulgt av fluorescence-aktivert cellesortering (FACS), basert på endotel-cellemarkør Cluster av differensiering (CD) 31 7, 8. FACS sortering og påfølgende cellekultur krever relativt store mengder av celler, og er derfor ikke egnet for isolering av endotelet fra små blodårer. Vi har derfor sikte på å utvikle en ny robust metode for å isolere en ren endotelceller befolkningen fra ulike hunde blodkar med høy renhet. For å teste effektiviteten av den nye isolasjonsmetoden, vi isolert og fått rene Canine Primær endotelcelle (CapeC) kulturer fra ulike hunde arterier og vener, både store og små. Denne metoden gjør det også kulturen i endotelceller som stammer fra syke og / eller avvikende fartøy som medfødte intra- eller ekstraleverPorto shunter, en vanlig sykdom hos hunder 2. Fremgangsmåten tillater isolering av flere relevante celletyper i samme beholder slik som vaskulære glatte muskelceller, siden mesteparten av beholderen forblir intopptre under prosedyren.
Protocol
Representative Results
Discussion
I studier som fokuserer på canine egenkapitalbevis den CnAOEC primære linjen brukes til å modellere endothelial linjer av hunden 3, 12, 13. I studier på mennesker, er HUVEC kulturen fortsatt regnet som gullstandarden. Åpenbart, med fokus bare på egenkapitalbevis avledet fra navlestreng er en fast begrensning i kardiovaskulær forskning. Endoteliale celler har en spesifikk genekspresjon mønster bestemmelse av arteriovenøse spesifikasjonen. For å ta hensyn til disse forskjellene i postnatal fartøy pre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Hans de Graaf and Tomas Veenendaal for their technical assistance in culturing the ECs.
Materials
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1X) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein. Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).
- Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines. BMC Vet. Res. 8 (1), 128 (2012).
- Boilson, B. A., et al. Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction. Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).
- Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis. PLoS One. 10 (4), e0124445 (2015).
- Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage. J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).
- Aranguren, X. L., et al. Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature. Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).
- van Balkom, B. W., et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183 (2007).
- Bustin, S. A., et al. MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments. BMC Mol. Biol. 11, 74 (2010).
- Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression. Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).
- Heishima, K., et al. MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases. Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).
- Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells. Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).
- van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected. The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).
- Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity. Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).
- Zhang, Q., et al. In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent. Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).
