العزلة والثقافة من الخلايا البطانية الأولية من الشرايين والأوردة الكلاب
Summary
Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.
Abstract
Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.
Introduction
وتستخدم الكلاب كنموذج الحيوانات الكبيرة لأبحاث أمراض القلب والأوعية الدموية ويمكن أيضا تعاني من وراثي (الوراثية) تشوهات الأوعية الدموية 1 و 2. ولدراسة هذه الأمراض غالبا ما تستخدم خطوط الخلايا البطانية التجارية لتقييم الخلايا البطانية وظيفة (EC). للكلاب هناك خط الخلية البطانية تجاري واحد متاح (CnAOEC)، والمستمدة من الشريان الأورطي الكلاب. يستخدم هذا الخط خلية معظمها في دراسات عن التحكم العادي ECS 3-5. في مجال البحوث القلب والأوعية الدموية البشري خطوط الخلايا البطانية الأكثر شيوعا هي خلايا الحبل السري الإنسان الوريد غشائي (HUVECs) والسري الإنسان الشريان الخلايا البطانية (HUAECs) المستمدة من الوريد البشري الحبل السري والشريان، على التوالي. وقد استخدمت HUVECs كمعيار ذهبي في مجال البحوث الأوعية الدموية منذ 1980s 6. وهي تعتبر أن النظام النموذج التقليدي لدراسة وظيفة بطانة الأوعية الدموية والتكيف مع المرض. الخلايا البطانية معزولة من الأوعية الدموية المختلفة تختلف في المظهره وظيفة بسبب الخلفية الوراثية والتعرض لالمكروية 7. وبالإضافة إلى ذلك، وتستمد HUVECs وHUAECs من الحبل السري، وهيكل الأوعية الدموية التنموية التي قد لا الأوعية الدموية الكبار تقليد تماما فيما يتعلق الظروف التي يتعرضون لها والاستجابة للمرض. وبالتالي، ترجمة نتائج في HUVECs وHUAECs لمرض القلب والأوعية الدموية بشكل عام غير كافية.
عند دراسة التكيف وسلوك الكبار ECS، ECS الأولية من السفينة من الاهتمام ينبغي أن تستخدم باعتبارها نهجا أكثر مباشرة. لعزل هذه الخلايا، وقد تم الإبلاغ عن العديد من الطرق. وهناك طريقة وصفها على نطاق واسع، والذي يستخدم أيضا لHUVECs، وفلاشينغ السفينة مع حل الهضم الأنزيمي 8. هذا غالبا ما يؤدي إلى تلوث مع غير ECS مثل خلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية 9. آخر الطريقة المستخدمة في كثير من الأحيان لعزل هو الهضم الأنزيمي من الأنسجة سفينة مفروم تليها fluorescence-خلية تنشيط الفرز (FACS) بناء على البطانية العنقودية خلية علامة على التمايز (CD) 31 7، 8. FACS الفرز وزراعة الخلايا اللاحقة تتطلب كميات كبيرة نسبيا من الخلايا وبالتالي فهي ليست مناسبة لعزل البطانة من الأوعية الدموية الصغيرة. وبالتالي فإننا تهدف إلى تطوير وسيلة قوية جديدة لعزل محض السكان الخلية البطانية من مختلف الأوعية الدموية الكلاب مع نقاء عالية. لاختبار كفاءة أسلوب العزلة جديد، ونحن عزل وحصل نقية الثقافات الناب الابتدائية الخلية البطانية (CaPEC) من الشرايين والأوردة الكلاب مختلفة، كبيرها وصغيرها. يتيح هذا الأسلوب أيضا ثقافة الخلايا البطانية التي تنشأ من المريضة و / أو الأوعية الشاذة مثل يحول بوابية مجموعية داخل الإقليم أو خارج الكبد وراثي، وهو مرض شائع في الكلاب 2. يسمح طريقة عزل أنواع الخلايا ذات الصلة إضافية من السفينة نفسها مثل خلايا العضلات الملساء الوعائية منذ أكثر من السفينة لا تزال كثافة العملياتالتصرف أثناء العملية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الدراسات التي تركز على الكلاب ECS يستخدم الخط الأساسي CnAOEC لنموذج الأنساب البطانية الكلب 3 و 12 و 13. في الدراسات الإنسانية، ثقافة HUVEC لا يزال يعتبر معيار الذهب. ومن الواضح أن مجرد التركيز على ECS المستمدة من الحبل السري هو تقييد راسخ في الأبحاث القلب والأوعية الدمو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Hans de Graaf and Tomas Veenendaal for their technical assistance in culturing the ECs.
Materials
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1X) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein. Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).
- Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines. BMC Vet. Res. 8 (1), 128 (2012).
- Boilson, B. A., et al. Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction. Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).
- Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis. PLoS One. 10 (4), e0124445 (2015).
- Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage. J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).
- Aranguren, X. L., et al. Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature. Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).
- van Balkom, B. W., et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183 (2007).
- Bustin, S. A., et al. MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments. BMC Mol. Biol. 11, 74 (2010).
- Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression. Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).
- Heishima, K., et al. MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases. Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).
- Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells. Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).
- van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected. The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).
- Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity. Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).
- Zhang, Q., et al. In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent. Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).
