Indução de Acidente Vascular Cerebral Isquêmico e isquemia-reperfusão em ratos usando a técnica de oclusão da artéria Oriente e Visualização de infarto Área

Summary

We describe a mouse model of stroke induced by the occlusion of the middle cerebral artery using a silicone coated suture. The protocol can be applied to induce permanent occlusion or a temporary ischemia, followed by reperfusion.

Abstract

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of stroke on tissue injury and to evaluate the effectiveness of therapeutic interventions, several experimental models in a variety of species were developed. They include complete global cerebral ischemia, incomplete global ischemia, focal cerebral ischemia, and multifocal cerebral ischemia. The model described in this protocol is based on the middle cerebral artery occlusion (MCAO) and is related to the focal ischemia category. This technique produces consistent focal ischemia in a strictly defined region of the hemisphere and is less invasive than other methods. The procedure described is performed on mice, given the availability of several genetic variants and the high number of tests standardized for mice to aid in the behavioral and neurodeficit evaluation.

Introduction

O estudo de doenças cardiovasculares, tais como acidente vascular cerebral, baseia-se na utilização de modelos in vivo. Para compreender a possível implicação de isquemia, toxicidade da droga, e / ou de tratamento, existe a necessidade de usar um modelo adequado, padronizada, fiável e reprodutível da doença, o que permite estudos comparativos entre os grupos de tratamento. Neste artigo, nós estamos usando ratos, dada a disponibilidade de um grande número de ratos transgénicos e modelos de avaliação padronizados. Raking pontuação para avaliar comportamento motor e déficits seguintes AVC isquêmico experimental ea seguinte de recuperação foram desenvolvidos ^{1, 2.}

Vários modelos de acidente vascular cerebral isquêmico estão disponíveis, tais como isquemia cerebral global, completa, isquemia global incompleta, isquemia cerebral multifocal e isquemia cerebral focal. O último grupo é também a categoria de acidente vascular cerebral em pacientes mais prevalente. A maioria dos eveNTS é iniciada pela formação de uma oclusão embólica ou trombótica na ou perto da artéria cerebral média (MCA). Tendo em conta estes parâmetros, o modelo apresentado imita a etiologia da doença de acidente vascular cerebral humano e faz com que os resultados obtidos altamente relevantes ^3. No entanto, a tradução de descobertas a partir de modelos animais para o tratamento da doença em seres humanos tem provado ser um desafio. Até agora, apenas a utilização de tecido trombolítica activador do plasminogénio tem sido aprovado para o tratamento de acidente vascular cerebral isquémico agudo ^4.

Entre os modelos de isquemia cerebral focal no rato, o modelo de circulação derrame cerebral posterior e modelo de trombose venosa cerebral são altamente invasivo, diminuindo a sua aplicabilidade e restringir a gama de análises que podem ser realizadas. No entanto, outras técnicas, tais como o modelo de embolia, modelo fototrombose, modelo de acidente vascular cerebral de endotelina-1 induzida, e a oclusão da artéria cerebral média sutura intraluminal (Hmodelo CAO), estão disponíveis para utilização sem estas limitações. O modelo MCAO é uma técnica descrita neste protocolo. Ela oferece um método de confiança de indução de isquemia cerebral focal que pode ser prontamente reperfundidos e realizada de um modo de alto rendimento. Existem duas abordagens para este modelo, ou seja, os métodos Zea-Longa e Koizumi. Eles diferem ligeiramente na forma como a sutura oclusão é inserido na vasculatura. Na técnica de Zea Longa-, a sutura é inserida através da artéria carótida externa ^5. A técnica aqui apresentada é modificado a partir do método Koizumi, em que o fio de sutura de oclus é inserida através da artéria carótida comum ^6.

O modelo MCAO foi aplicado com sucesso para avaliar diferentes eventos que ocorrem durante o acidente vascular cerebral isquêmico. Após reperfusão, edema cerebral pode ser observada juntamente com a ruptura da barreira sangue-cérebro. Pico da morte neuronal é geralmente observada em 24 h; No entanto, ele revolta-se para os níveis basais após 7 dias ^7. Nos seres humanos, o sexo ea idade são variáveis importantes na determinação do resultado do curso, o que também é observado em camundongos e ratos ^{8, 9, 10.} Várias publicações têm utilizado o modelo MCAO para demonstrar a eficácia do tratamento ^{11, 12, 13, 14.}

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pela Universidade de Miami Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC), de acordo com os Institutos Nacionais de diretrizes de Saúde (NIH). É necessária a utilização de equipamento estéril e técnicas assépticas. 1. Preparar o Oclusão Sutura Utilize uma sutura de 0,21 mm de diâmetro para os ratos entre 20-25 g e 0,23 mm para os ratos entre 25 – 35 g de peso corporal. A escolha do tipo de sutura para o procedimento MCAO depende …

Representative Results

O percurso de inserção do fio de sutura oclusão é demonstrado na Figura 1. A sutura MCAO é para ser encaminhado para a área de oclusão, bifurcando na ICA. oclusão bem sucedida do MCA vai levar à lesão tecidual, visível por coloração TTC. A Figura 2 apresenta imagens de manchas de animais com tratamento simulado (Figura 2A) e de um 60 min de reperfusão de isquemia MCAO animais (coloração em 90 minutos ou 24 horas após a o…

Discussion

A utilização com sucesso do método descrito MCAO é altamente dependente de uma compreensão da anatomia do fluxo sanguíneo cerebral. Desde o posicionamento correto da sutura é difícil discernir devido à falta de pistas visuais diretos, a prática repetida é importante dominar o procedimento antes de usá-lo para estudos de investigação. volume de curso devem ser analisados ​​para garantir resultados consistentes. A adição de um sistema de laser Doppler pode ajudar a determinar o sucesso da oclusão do f…

Materials

MCAO suture 0.23mm	Doccol	702345PK5Re
MCAO suture 0.21mm	Doccol	702145PK5Re
Silver pen	staples	503205
Anesthesia machine	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine science tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine science tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine science tool	00109-11
Spring scissors	Fine science tool	15000-08
Nylon suture	Braintree scintific	SUT-S 104
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherSci	50-121-8005
Brain block	Braintree scintific	BS-A 5000C
Cryostat blade	VWR	89202-606
Optional:
Periflux Laser doppler system	Perimed	Periflux 5000
Monitoring unit	Perimed	PF 5010 – LDPM