La confirmación de la isquemia miocárdica y reperfusión en ratones utilizando electrocardiografía de superficie del cojín

Summary

During murine myocardial ischemia/reperfusion surgery, correct placement of the occluding ligature is typically confirmed by visible observation of myocardial pallor. Herein, a method of electrocardiographically confirming ischemia and reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, is demonstrated in male C57Bl/6 mice.

Abstract

Many animal models have been established for the study of myocardial remodeling and heart failure due to its status as the number one cause of mortality worldwide. In humans, a pathologic occlusion forms in a coronary artery and reperfusion of that occluded artery is considered essential to maintain viability of the myocardium at risk. Although essential for myocardial recovery, reperfusion of the ischemic myocardium creates its own tissue injury. The physiologic response and healing of an ischemia/reperfusion injury is different from a chronic occlusion injury. Myocardial ischemia/reperfusion injury is gaining recognition as a clinically relevant model for myocardial infarction studies. For this reason, parallel animal models of ischemia/reperfusion are vital in advancing the knowledge base regarding myocardial injury. Typically, ischemia of the mouse heart after left anterior descending (LAD) coronary artery occlusion is confirmed by visible pallor of the myocardium below the occlusion (ligature). However, this offers only a subjective way of confirming correct or consistent ligature placement, as there are multiple major arteries that could cause pallor in different myocardial regions. A method of recording electrocardiographic changes to assess correct ligature placement and resultant ischemia as well as reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, would help yield consistent infarct sizes in mouse models. In turn, this would help decrease the number of mice used. Additionally, electrocardiographic changes can continue to be recorded non-invasively in a time-dependent fashion after the surgery. This article will demonstrate a method of electrocardiographically confirming myocardial ischemia and reperfusion in real time.

Introduction

Las enfermedades del corazón siguen siendo la causa principal de muerte en todo el mundo ^1,2. No sólo es el ventrículo izquierdo (LV) de la cámara de más muscular, responsable de bombear sangre desde el corazón a todo el cuerpo ^3, es un sitio común la lesión cardiaca post-infarto de miocardio ^4. la muerte del tejido del ventrículo izquierdo a menudo resulta en insuficiencia cardíaca sistólica. Los modelos animales de enfermedades del corazón son imprescindibles para el avance de la investigación biomédica cardiovascular. La cepa C57BL / 6 ratones de haber sido una opción popular para los modelos animales debido a su tiempo de reproducción rápida, de bajo costo y facilidad de alteraciones genéticas. La mayoría de los modelos murinos quirúrgicos para el estudio de las enfermedades del corazón implican la oclusión de la rama LAD de la arteria coronaria izquierda. El LAD a veces se llama la izquierda obtusa marginal ^5,6. El LAD suministra sangre a la cara anterior del ventrículo izquierdo y paredes anterolateral. Los estudios de oclusión LAD están dirigidas a inducir infartos anteriores, a veces se extiende into las zonas de la pared inferior y lateral ^7.

Dos modelos que se utilizan con frecuencia para estudios de infarto de miocardio incluyen infarto de miocardio oclusión crónica y daño por isquemia / reperfusión miocárdica. La oclusión crónica se crea mediante sutura quirúrgica alrededor y bloquear permanentemente el flujo de sangre a través de la LAD. La lesión de isquemia / reperfusión se crea mucho de la misma manera solamente con un transitorio, por lo general 30 a 60 min, período de isquemia. Para lograr la isquemia transitoria, los lazos de oclusión de sutura alrededor de la LAD y un pequeño tubo de PE-10 que se coloca paralela a la LAD sobre la superficie epicárdica del corazón, seguido de un período de reperfusión, donde se retira el tubo y sutura oclusiva y la sangre es dejó fluir una vez más a través de la arteria y en el miocardio. La cirugía de isquemia / reperfusión se ha considerado que sea clínicamente relevante debido a la naturaleza de la lesión por reperfusión en paralelo el tratamiento de infartos de humanos que incluye promangioplastia y colocación de stent coronario pt de la arteria, o cirugía de revascularización coronaria. Típicamente, durante estas cirugías, isquemia del VI en un corazón de ratón se confirma por la palidez visible de la pared miocárdica. Sin embargo, simplemente realizando las cirugías en una almohadilla de electrocardiograma (ECG) en condiciones de control constantes, cambios visibles se pueden observar en la forma de onda ECG, lo que confirma la isquemia y reperfusión del miocardio ratón.

Aunque el corazón murino es similar al corazón humano, en muchos aspectos, incluyendo su estructura de cuatro cámaras, los corazones también tienen diferencias. Una diferencia obvia es la frecuencia cardíaca en reposo promedio de ratones adultos es de 600 – 700 latidos por minuto (lpm), mientras que la de los humanos adultos se muestran ~ 60-100 lpm ^8,9. Además, en los ratones las olas de la repolarización, J y T, a menudo se confunden con las ondas QRS despolarización hacer un segmento ST clara difícil discernir ^10. Para complicar el proceso de electrocardiographically confirmando la isquemia miocárdica, es la elevación de la onda T y del segmento ST que se utilizan como marcadores para el diagnóstico de la isquemia y lesión por infarto de miocardio en los seres humanos, en lo clínicamente como ST e levation m yocardial i nfarction o STEMI. Una de las principales diferencias entre las formas de onda humanos y murinos es que la onda S es seguida inmediatamente ser una onda J que transfiere directamente a una onda T negativa. Durante la isquemia miocárdica aguda en ratones disminuye la amplitud de la onda S y es seguido directamente por un J-onda anormal y una onda T invertida ^11. La onda T no parece representar una parte significativa de la repolarización en ratones ^11. A pesar de la nomenclatura y de ratón frente a las diferencias humanas, la confirmación ECG de la isquemia miocárdica y la reperfusión murino es todavía viable y relativamente simple. En aras de la simplificación de interpretación de forma de onda, el segmento entre el SJT se conoce como ST-SEGMnt en este documento.

Directrices STEMI publicados en 2013 recomiendan un tiempo de paciente-puerta-balón de menos de 90 min ¹² .Este significa que el marco de tiempo de la identificación de oclusión de la arteria coronaria del paciente hasta que la arteria se vuelva a abrir debe ser inferior a 90 min. El corazón que late está trabajando constantemente y por lo tanto, tiene un alto metabolismo oxidativo y un alto nivel de consumo de oxígeno ^3. Para prever esto, en una red de capilares está disponible para cada uno de los miocitos ^3. Sólo se necesita un corazón un par de compases para agotar su oxígeno y nutrientes. En una ventana de 90 minutos, una región isquémica del corazón en un ser humano habrá sido bloqueado para recibir entre 5.400 y 9.000 corazón late valor de la sangre rica en oxígeno. En esa misma ventana de 90 minutos, un ratón tendría 54.000 a 63.000 latidos del corazón. puntos de tiempo experimentales para la lesión por isquemia / reperfusión murino son típicamente entre 30 y 60 min.

La importancia de desarrollaring un método suplementario de confirmar la isquemia miocárdica y la reperfusión en un modelo murino tiene profundas implicaciones en la consistencia y reproducibilidad de los datos en los estudios de isquemia / reperfusión miocárdica. La práctica actual de observar visualmente el corazón de un cambio de color de los tejidos no es adecuada como independiente de diagnóstico. Además, la reperfusión después de la eliminación de la tubería y la sutura no está garantizada. A pesar de la arteria ya no se liga, la arteria puede tener daño sostenido durante el procedimiento y puede llegar a ser imposible reperfundir. Sería beneficioso tener un registro de los cambios electrocardiográficos para confirmar la reperfusión en lugar de confiar en las observaciones de la palidez del miocardio y rubor (color rojo). Corazones que no muestran los marcadores de lesión por isquemia / reperfusión pueden ser marcados a continuación, de forma rápida y una decisión sobre la forma de proceder se pueden hacer por los investigadores.

Por último, el establecimiento de un registro de ECG cambios desde el inicio en toda THe períodos de isquemia y reperfusión permite a los investigadores continúan vigilando el corazón después de la cirugía inicial. Los investigadores actualmente pierden de vista el corazón tan pronto como se haya completado la operación. El ECG es una forma sencilla de obtener una perspectiva de los cambios que ocurren en las horas de miocardio días después de la cirugía. ECG grabado en los puntos de tiempo después de la cirugía podría revelar ondas Q de desarrollo tardío que indica continuaron o empeoramiento de la muerte del tejido. Sin embargo, para calibrar de manera efectiva marcadores nuevos o que empeoran electrocardiográficos, un ECG basal debe estar disponible para la comparación.

Este protocolo demostrará cómo preparar, obtener e interpretar el ECG para confirmar la isquemia y reperfusión del corazón de ratón usando 8 – 12 semanas de edad de sexo masculino C57BL / 6 ratones.

Protocol

Todos los procedimientos quirúrgicos realizados en animales deben llevarse a cabo de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 13 u otras directrices éticas apropiadas. Los protocolos deben ser aprobados por el comité de bienestar de los animales en la institución apropiada antes de continuar. 1. Preparación para el ECG NOTA: Antes de comenzar, se pongan el equipo de protección personal, incluyendo guantes, gafas y b…

Representative Results

Un ECG normal de murino se muestra en la Figura 2 con los marcadores alfabéticos para eventos eléctricos P, Q, R, S, T. J y P es la despolarización auricular inicial. QRS es la onda de despolarización en los ventrículos. J es la repolarización temprana y T representa la repolarización heterogénea también conocida como la recuperación 11. Cabe señalar que muchos laboratorios no utilizan la nomenclatura de onda J y en lugar de referirse a la SJT-segme…

Discussion

El uso de cambios en el ECG como un método complementario para la confirmación de la isquemia miocárdica y la reperfusión asegura la colocación precisa de la ligadura de oclusión. La exactitud de la colocación de ligadura es fundamental para reducir la variabilidad de los datos entre los animales. El LAD en un corazón de ratón es una arteria difícil de visualizar. Por lo tanto, que complementa palidez visual con cambios electrocardiográficos ayudará a asegurar la colocación correcta del daño a los tejidos …

Materials

Vevo 1100	Fujifilm Visual Sonics		Echocardiography Machine
Mouse Handling Plate	Fujifilm Visual Sonics		Heated ECG plate
Signa-Gel			Highly Conductive Multi-
Electrode Gel	Parker	15-25	Purpose Electrolyte
Transpore Medical Tape	3M	1527-0
PI-Spray II	Pharmaceutical Innovations	NDC 36-2013-25	Cleaning agent for ECG plate
C57Bl6 Mice	The Jackson Laboratory	000664	Male, 8-12 wk
IsoThesia-Isoflurane	Henry Schein	NDC 1169-0500-1
Excel	Microsoft
Systane Nighttime Lubricant Eye Ointment	Alcon	65050935
7-0 Perma-Hand Silk Sutures	Ethicon	640.O32
5-0 Perma-Hand Silk Sutures	Ethicon	K809.O32
Surgical Scissors	ROBOZ	RS-5881
Forceps	Fine Science Tools	11052-10
Gauze	Bio Nuclear Diagnostics Inc	DIS-022B
Needle Holder	Fine Science Tools	12565-14
Buprenex CIII	Patterson Veterinary	0-891-9756	Buprenorphine Hydrochloride Analgesic
Betadine	Purdue Products	67618-150-08