Bekräftelse av ischemi och reperfusion skada i möss med användning av Surface Pad Elektrokardiografi
Summary
During murine myocardial ischemia/reperfusion surgery, correct placement of the occluding ligature is typically confirmed by visible observation of myocardial pallor. Herein, a method of electrocardiographically confirming ischemia and reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, is demonstrated in male C57Bl/6 mice.
Abstract
Many animal models have been established for the study of myocardial remodeling and heart failure due to its status as the number one cause of mortality worldwide. In humans, a pathologic occlusion forms in a coronary artery and reperfusion of that occluded artery is considered essential to maintain viability of the myocardium at risk. Although essential for myocardial recovery, reperfusion of the ischemic myocardium creates its own tissue injury. The physiologic response and healing of an ischemia/reperfusion injury is different from a chronic occlusion injury. Myocardial ischemia/reperfusion injury is gaining recognition as a clinically relevant model for myocardial infarction studies. For this reason, parallel animal models of ischemia/reperfusion are vital in advancing the knowledge base regarding myocardial injury. Typically, ischemia of the mouse heart after left anterior descending (LAD) coronary artery occlusion is confirmed by visible pallor of the myocardium below the occlusion (ligature). However, this offers only a subjective way of confirming correct or consistent ligature placement, as there are multiple major arteries that could cause pallor in different myocardial regions. A method of recording electrocardiographic changes to assess correct ligature placement and resultant ischemia as well as reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, would help yield consistent infarct sizes in mouse models. In turn, this would help decrease the number of mice used. Additionally, electrocardiographic changes can continue to be recorded non-invasively in a time-dependent fashion after the surgery. This article will demonstrate a method of electrocardiographically confirming myocardial ischemia and reperfusion in real time.
Introduction
Hjärtsjukdom är den främsta dödsorsaken i världen 1,2. Inte bara är den vänstra kammaren (LV) den mest muskulösa kammare, som ansvarar för att pumpa blod från hjärtat till hela kroppen 3, är det en vanlig hjärtskada plats efter hjärtinfarkt 4. Vänsterkammar vävnadsdöd resulterar ofta i systoliskt hjärtsvikt. Djurmodeller av hjärtsjukdom är absolut nödvändigt för att främja biomedicinsk kardiovaskulär forskning. C57BL / 6-stammen av möss har varit ett populärt val för djurmodeller på grund av deras snabba avel tid, låg kostnad och lätthet i genetiska förändringar. De flesta murina kirurgiska modeller för studiet av hjärtsjukdomar involverar ocklusion av LAD grenen av den vänstra kransartären. LAD kallas ibland den vänstra trubbiga marginella 5,6. Den LAD levererar blod till vänster kammar främre och antero-laterala väggar. LAD ocklusion studier syftar till att inducera främre infarkter, ibland sträcker sig into de lägre och sidoväggområdena 7.
Två modeller som används ofta för hjärtinfarkt studier inkluderar kronisk ocklusion hjärtinfarkt och ischemi / reperfusionsskada. Den kroniska ocklusion skapas genom att kirurgiskt suturering runt och permanent blockera blodflödet genom LAD. Ischemi / reperfusionsskada skapas mycket på samma sätt endast med en övergående, vanligen 30-60 min, ischemiska perioden. För att uppnå övergående ischemi, de ockluderande sutur banden runt LAD och en liten PE-10 rör, som är placerade parallellt med LAD på epikardiella ytan av hjärtat, följt av en reperfusionsperiod där slangen och ockluderande sutur avlägsnas och blod är tillåts att återigen strömma genom artären och in i hjärtmuskeln. Ischemi / reperfusion kirurgi har bedömts vara kliniskt relevant på grund av arten av reperfusionsskada parallellt behandling av humana infarkter som inkluderar prompt koronar angioplastik och stentning av artären, eller koronar bypass. Typiskt under dessa operationer, är ischemi i LV i en mus hjärta bekräftas genom synliga blekhet av hjärtmuskelväggen. Men genom att helt enkelt utföra de operationer på ett elektrokardiogram (EKG) pad under konstanta betingelser övervaknings, kan observeras synliga förändringar i EKG-kurvan, vilket bekräftar ischemi och reperfusion av musen myokardiet.
Även om den murina hjärtat liknar det mänskliga hjärtat i många avseenden, bland annat dess fyra-chambered struktur, hjärtan har också skillnader. En uppenbar skillnad är den genomsnittliga vilopuls av vuxna möss är 600 – 700 slag per minut (bpm), medan den för vuxna människor är i ~ 60-100 bpm 8,9. Dessutom, i möss repolariserings vågor, J och T, samman ofta med depolarisation QRS-komplex att göra en tydlig ST-segmentet svårt att urskilja 10. För att komplicera processen för electrocardiographically bekräftar myokardischemi, det är höjden av den T-vågen och ST-segmentet som används som markörer för diagnos av ischemi och myokardinfarkt skada i människor, kliniskt kallad ST e levation m yocardial jag nfarction eller STEMI. En av de viktigaste skillnaderna mellan humana och murina vågformer är att S-vågen följs omedelbart vara en J-våg som överför direkt i en negativ T-vågen. Under akut myokardial ischemi hos möss amplituden hos S-våg minskar och detta följs av en onormal J-våg och en inverterad T-vågen 11. T-vågen verkar inte representera en betydande del av den repolarisering i möss 11. Trots nomenklatur och mus mot människors olikheter, är EKG bekräftelse på mus myokardischemi och reperfusion fortfarande möjligt och relativt enkelt. För tydlighetens enklare tolkning vågform, är segmentet mellan SJT kallad ST-segment häri.
STEMI riktlinjer 2013 rekommenderar en patient dörr till ballong på mindre än 90 min 12 .Detta innebär att tidsramen från identifieringen av patientens kransartärtilltäppning tills artären öppnas igen bör vara mindre än 90 minuter. Beating heart arbetar ständigt och därför har en hög oxidativ metabolism och en hög nivå av syreförbrukning 3. För att åstadkomma detta, är tillgänglig för varje myocyte 3 ett nätverk av kapillärer. Det tar bara ett hjärta några slag att uttömma sitt syre och näringstillförsel. I en 90 min fönster, kommer en ischemisk hjärtregionen i en människa har blockerats från att ta emot mellan 5400 och 9000 hjärtslag värde av syrerikt blod. I samma 90 min fönster skulle en mus har 54.000 till 63.000 hjärtslag. Experimentella tidpunkter för murin ischemi / reperfusionsskada är typiskt mellan 30 och 60 min.
Vikten av att utvecklaing en kompletterande metod för att bekräfta myokardischemi och reperfusion i en musmodell har djupgående konsekvenser på enhetlighet och reproducerbarhet av data i myokardischemi / reperfusion studier. Nuvarande praxis visuellt observera hjärta för en förändring i vävnads färg är inte tillräckligt som en fristående diagnostik. Dessutom är reperfusion efter avlägsnande av slangen och sutur inte garanterad. Även artären inte längre bunden av, kan artären har lidit skada under förfarandet och kan bli omöjligt att reperfundera. Det skulle vara fördelaktigt att ha ett register över elektrokardiografiska förändringar för att bekräfta reperfusion snarare än att förlita sig på observationer av hjärtinfarkt blekhet och rodnad (röd färg). Hjärtan som inte visar de markörer för ischemi / reperfusionsskada kan sedan snabbt flaggas och ett beslut om hur man ska gå kan göras av utredarna.
Slutligen, inrättande av en förteckning över EKG-förändringar från baslinjen hela the ischemiska och reperfusion perioder kan utredarna att fortsätta att övervaka hjärtat efter den första operationen. Utredare förlorar närvarande åsynen av hjärtat så snart som operationen är avslutad. EKG är ett enkelt sätt att få insikt i de förändringar som sker i hjärtmuskeln timmar till dagar efter operationen. EKG registreras vid tidpunkter efter operationen kunde avslöja sent utveckla Q-vågor indikerar fortsatt eller förvärrad vävnadsdöd. Men för att effektivt gage nya eller förvärrade elektrokardiografiska markörer, ett EKG måste vara tillgängliga för jämförelse.
Detta protokoll kommer att visa hur man förbereder, erhålla och tolka EKG för att bekräfta ischemi och reperfusion av musen hjärtat med hjälp av 8-12 veckor gamla C57BL / 6 möss.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med användning av EKG-förändringar som en kompletterande metod för bekräftelse av myokardischemi och reperfusion säkerställer noggrann placering av ockluderande ligaturen. Noggrannhet av ligatur placering är avgörande för att minska uppgifter variationsrikedomen bland djur. LAD i en mus hjärta är en svår artär att visualisera. Därför kommer komplettera visuell blekhet med EKG förändringar bidrar till den korrekta placeringen av ligatur och resulterande vävnadsskada.
Efters…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Merit Review awards (BX002332 and BX000640) from the Biomedical Laboratory Research and Development Service of the Veterans Affairs Office of Research and Development, National Institutes of Health (R15HL129140), and funds from Institutional Research and Improvement account. The project is supported in part by the National Institutes of Health grant C06RR0306551.
Materials
| Vevo 1100 | Fujifilm Visual Sonics |
Echocardiography Machine | |
| Mouse Handling Plate | Fujifilm Visual Sonics |
Heated ECG plate | |
| Signa-Gel | Highly Conductive Multi- | ||
| Electrode Gel | Parker | 15-25 | Purpose Electrolyte |
| Transpore Medical Tape | 3M | 1527-0 | |
| PI-Spray II | Pharmaceutical Innovations | NDC 36-2013-25 | Cleaning agent for ECG plate |
| C57Bl6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, 8-12 wk |
| IsoThesia-Isoflurane | Henry Schein | NDC 1169-0500-1 | |
| Excel | Microsoft | ||
| Systane Nighttime Lubricant Eye Ointment | Alcon | 65050935 | |
| 7-0 Perma-Hand Silk Sutures | Ethicon | 640.O32 | |
| 5-0 Perma-Hand Silk Sutures | Ethicon | K809.O32 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ | RS-5881 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Gauze | Bio Nuclear Diagnostics Inc | DIS-022B | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Buprenex CIII | Patterson Veterinary | 0-891-9756 | Buprenorphine Hydrochloride Analgesic |
| Betadine | Purdue Products | 67618-150-08 |
References
- Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Xu, J. Deaths: Final Data for 2011. Natl Vital Stat Rep. 63 (3), 1-120 (2015).
- Klabunde, R. E. . Cardiovascular Physiology Concepts 2edn. , 243 (2012).
- Bhardwaj, R., Kandoria, A., Sharma, R. Myocardial infarction in young adults-risk factors and pattern of coronary artery involvement. Niger Med J. 55 (1), 44-47 (2014).
- Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. A murine model of myocardial ischemia-reperfusion injury through ligation of the left anterior descending artery. J Vis Exp. (86), (2014).
- Fernández, B., et al. The coronary arteries of the C57BL/6 mouse strains: implications for comparison with mutant models. J Anat. 212 (1), 12-18 (2008).
- Thaler, M. S. . The Only EKG Book You’ll Ever Need. , (2003).
- Poirier, P. Exercise, heart rate variability, and longevity: the cocoon mystery?. Circulation. 129 (21), 2085-2087 (2014).
- Boudoulas, K. D., Borer, J. S., Boudoulas, H. Heart Rate, Life Expectancy and the Cardiovascular System: Therapeutic Considerations. Cardiology. 132 (4), 199-212 (2015).
- Wehrens, X. H., Kirchhoff, S., Doevendans, P. A. Mouse electrocardiography: an interval of thirty years. Cardiovasc Res. 45 (1), 231-237 (2000).
- Boukens, B. J., Rivaud, M. R., Rentschler, S., Coronel, R. Misinterpretation of the mouse ECG: ‘musing the waves of Mus musculus. J Physiol. 592 (21), 4613-4626 (2014).
- O’Gara, P. T., et al. ACCF/AHA guideline for the management of ST-elevation myocardial infarction: executive summary: a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines: developed in collaboration with the American College of Emergency Physicians and Society for Cardiovascular Angiography and Interventions. Catheter Cardiovasc Interv. 82 (1), E1-E27 (2013).
- . . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2011).
- Gao, S., Ho, D., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Echocardiography in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 1, 71-83 (2011).
- Jong, W. M., et al. Reduced acute myocardial ischemia-reperfusion injury in IL-6-deficient mice employing a closed-chest model. Inflamm Res. 65 (6), 489-499 (2016).
- Nadtochiy, S. M., et al. In vivo cardioprotection by S-nitroso-2-mercaptopropionyl glycine. J Mol Cell Cardiol. 46 (6), 960-968 (2009).
- Preda, M. B., Burlacu, A. Electrocardiography as a tool for validating myocardial ischemia-reperfusion procedures in mice. Comp Med. 60 (6), 443-447 (2010).
- Speerschneider, T., Thomsen, M. B. Physiology and analysis of the electrocardiographic T wave in mice. Acta Physiol (Oxf. 209 (4), 262-271 (2013).
- Kersten, J. R., Schmeling, T. J., Pagel, P. S., Gross, G. J., Warltier, D. C. Isoflurane mimics ischemic preconditioning via activation of K(ATP) channels: reduction of myocardial infarct size with an acute memory phase. Anesthesiology. 87 (2), 361-370 (1997).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53 (1), E55-E69 (2012).
- Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacol Ther. 139 (2), 213-248 (2013).
