Introduction
La insuficiencia cardiaca es un síndrome complejo clínica, los síntomas de los cuales incluyen fatiga, disnea, intolerancia al ejercicio, y la retención de líquidos en los tejidos periféricos. Es la causa principal de muerte en los países desarrollados 1. Aparte de la miocardiopatía hereditaria causada por mutaciones en las proteínas del sarcómero o canales de iones 2, disfunción miocárdica puede ser causado por una variedad de condiciones médicas, incluyendo la hipertensión, las enfermedades cardíacas valvulares, la obesidad y la diabetes 3. Los cambios en la estructura del miocardio, la conducción eléctrica, y el plomo metabolismo energético a insuficiente capacidad de bombeo cardiaco para satisfacer la demanda circulatoria, que en última instancia se traduce en insuficiencia cardíaca 3,4. La investigación de los mecanismos que subyacen a la insuficiencia cardíaca, por lo tanto, es fundamental en el campo de la investigación cardiovascular. La identificación de los mecanismos moleculares que conducen a la progresión de la insuficiencia cardíaca con el tiempo puede ayudar en el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas o biomarcadores útiles
La hipertrofia cardiaca y remodelación juega un papel crítico en el desarrollo de la insuficiencia cardíaca. La cardiopatía hipertensiva es el factor clave que contribuye de la hipertrofia cardíaca y la remodelación de mala adaptación observada en pacientes humanos 1. Para imitar estas condiciones humanas, los modelos animales a menudo se establecen a través de procedimientos quirúrgicos. En particular, la aorta abdominal transversal o puede ser constreñido para aumentar la resistencia contra el ventrículo izquierdo, que en última instancia conduce a una sobrecarga de presión en el corazón. Este fenómeno da lugar generalmente a la hipertrofia cardíaca, una compensación fisiológica de los cardiomiocitos para satisfacer la demanda funcional del sistema cardiovascular. Sin embargo, la demanda funcional anula los mecanismos compensatorios fisiológicos normales, lo que conduce a la fibrosis cardiaca y Contracdeterioro del azulejo. cirugía transversal constricción de la aorta (TAC) a menudo implica procedimientos complicados, incluyendo toracotomía, la ventilación mecánica y la separación del timo y el tejido graso del arco aórtico. Por el contrario, constricción de la aorta abdominal requiere técnicas experimentales simples 6-8. La aorta abdominal, entre la izquierda y la arteria renal derecha, se constriñe durante la cirugía. La hipertrofia cardiaca y la remodelación se pueden observar varias semanas después de la cirugía constricción de la aorta abdominal 6-8; que producen la enfermedad cardíaca hipertensiva robusta similar a la generada por la cirugía constricción de la aorta transversal 9,10. A continuación, se describe un protocolo para llevar a cabo la constricción de la aorta abdominal en ratas utilizando un método eficiente y altamente reproducible y mínimamente invasiva. La aorta abdominal adyacente a las arterias renales se estrecha por un bucle de 0,72 mm formada por un hilo de seda 4-0. Diez semanas después de la cirugía, la hipertrofia cardíaca y Remodelinse puede observar g. El modelo de rata de la hipertrofia cardíaca constricción inducida por la aorta abdominal proporciona una plataforma para el estudio de mecanismos de la enfermedad y la fisiopatología, así como el desarrollo de terapias potenciales.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, publicada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH publicación no. 85-23, revisada en 1996). Este protocolo fue aprobado por y de acuerdo con las directrices establecidas por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en la Universidad Nacional de Taiwán.
1. Cirugía Animal
- Preparar una aguja G 22 jeringa embotando la punta de la aguja en una piedra de afilado. Con unas pinzas, plicar la aguja a un ángulo recto.
- Antes de la cirugía, la preparación de los instrumentos necesarios quirúrgicos y materiales, así como una jaula de recuperación. Autoclave todos los instrumentos y suministros quirúrgicos antes de su uso.
- Mantener las ratas alrededor de 200 g, y mantenerlos bajo 12 horas de luz / oscuridad ciclos a una temperatura controlada (21 ± 2 ° C) con acceso libre a comida y agua. Incluye por lo menos 6 ratas de cada grupo. Anestesiar las ratas con pentobarbital(75 mg / kg en 0,5 ml, ip) u otro agente anestésico adecuado. Confirmar la profundidad de la anestesia probando el reflejo de la cola.
NOTA: La ausencia de reflejo de la cola es un indicador de la anestesia adecuada. - Colocar una rata en posición supina sobre una plataforma de la cirugía con una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura del cuerpo. Afeitarse la región abdominal de la rata con una cortadora de cabello animal y loción removedor del pelo para evitar contaminaciones quirúrgicos. Frote el abdomen limpiamente afeitada con betadine u otro reactivo de limpieza antes de la cirugía.
NOTA: Es importante mantener un campo estéril durante todo el procedimiento. - Se practica una incisión de 2 cm a lo largo de la línea media del abdomen con un bisturí. El uso de solución salina normal, mantenga el órgano abdominal húmeda durante la cirugía. Plegar los órganos digestivos con cuidado a un lado el uso de bolas de algodón para exponer la vena cava inferior que se encuentra en la región peritoneal posterior. Identificar la aorta abdominal, que se encuentra yuxtapuesta a y por lo general en elizquierdo de la vena cava inferior.
NOTA: La aorta abdominal es el recipiente que late al ritmo de la frecuencia cardiaca. - Perforar el peritoneo con un par de pinzas para descubrir los vasos debajo. aislar suavemente la aorta abdominal adyacente a las arterias renales y aprobar un 8 cm de longitud sutura de seda 4-0 por debajo de la aorta abdominal entre los orígenes de la derecha y la izquierda arterias renales.
- Hacer un doble nudo flojo con la sutura; dejar un bucle de 3 mm de diámetro, y colocar la aguja 22 G romo y se inclinó dentro del bucle. Apretar el nudo alrededor de la aorta y la aguja y retire la aguja de inmediato para lograr una constricción de 0,7 mm de diámetro.
- Cierre de la cavidad abdominal con 6-0 material de sutura absorbible. Suturar las incisiones del músculo o la piel con suturas interrumpidas simples. Para prevenir la infección, frote la zona quirúrgica con una tintura de yodo.
- Observar el animal con cuidado hasta que recupere la conciencia suficiente, como se indica por la libre circulacióny la ingesta de alimentos. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. Para prevenir el dolor después de la cirugía, el tratamiento de la rata con paracetamol (300 mg / kg en 0,5 ml, ip).
NOTA: Los usuarios deben administrar analgésicos según lo aprobado por las políticas institucionales.
2. Tejido y Recogida de muestras de sangre
- A las 10 semanas posteriores a la cirugía, pese la rata y anestesiar con pentobarbital (75 mg / kg en 0,5 ml, ip). Antes de la cirugía, confirmar la profundidad de la anestesia mediante pruebas de su reflejo de la cola. Coloque la rata en una bandeja de metal.
- Se practica una incisión de 2 cm a lo largo de la línea media del cuello utilizando un bisturí. Plegar los músculos cuidadosamente con unas pinzas para exponer la tráquea. Observe cuidadosamente para identificar las arterias carótidas, que son paralelas a la tráquea y pulsan en el tiempo con la frecuencia cardíaca.
- Recoger la sangre de la arteria carótida en un tubo de recogida de sangre revestido con EDTA. inmediatamente centrífugala sangre durante 15 minutos a 2000 xg y recoger el plasma. Almacenar el plasma sanguíneo a -80 ° C hasta que se necesite.
- Hacer una incisión de 5 cm en la región torácica, alrededor de la línea media del proceso xifoides. Perforar el diafragma con pinzas cortantes. Con un par de tijeras, cortar y quitar la caja torácica a lo largo de las líneas de media clavicular en ambos lados para exponer el corazón. Escindir el corazón cuidadosamente a lo largo de las fronteras cardíacas y vasculares. Retire el corazón suavemente sin agarrar el tejido.
- Montar el corazón en un aparato de perfusión Langendorff modificado por atar el tronco aórtico a la aguja de perfusión. Perfundir el corazón con tampón de Krebs (NaCl 110 mM que contiene, KCl 2,6 mM, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1.2 mM de MgSO4, NaHCO3 25 mM y glucosa 11 mM [pH 7,4]) para lavar la sangre. Se pesa el corazón y calcular el índice corazón de peso a peso corporal. Fijar el corazón con 4% de paraformaldehído en el hielo. Recuerde usar una máscara, ya que el vapor es paraformaldehído toxic.
3. Cuantificación del tejido de la fibrosis
- Coloque el tejido del corazón paraformaldehído-fijo en un dispositivo de seccionamiento de tejido y corte de 2 mm de grosor. Colocar las secciones de tejido en un casete de la incrustación. Deshidratar el tejido a través de una serie de baños de alcohol graduadas (50%, 75%, 95%, y 100% durante 1 hora cada uno).
- Infiltrarse en el tejido con xileno durante 1 hora y finalmente en la cera durante 1 hora. Coloque el tejido infiltrado en un casete de inclusión y empotrar con cera de parafina. Almacenar los tejidos embebidos en bloques de parafina a temperatura ambiente hasta que microtomo.
- Cortar el tejido embebido en 4 micras de grosor. Coloque las secciones en un baño de agua de 45 ºC. Sumergir un portaobjetos de vidrio en el baño de agua a un ángulo y acercarse poco a poco los bordes de sección de parafina para permitir la unión parcial a la diapositiva.
- Mueva el deslizarse dentro y fuera del baño para eliminar las posibles burbujas de aire debajo de la sección de tejido y para facilitar una mejor unión. t secase desliza a 37 ºC durante 1 hora y almacenar a temperatura ambiente durante la tinción histológica.
- Ponga la diapositiva en un tanque. Desparafinar el portaobjetos con xileno durante 30 min y rehidratar en alcohol diluido secuencialmente (95%, 75%, y 50% para 3 min cada uno) y finalmente en agua destilada. Utilice solución de color rojo picrosirius adecuada para cubrir completamente las secciones de tejido durante 1 hora. Enjuague los portaobjetos en una solución de ácido acético al 0,5% para los dos cambios, y luego realizar dos lavados en alcohol absoluto.
- El aire seco de la corredera y el soporte de diapositivas en resina sintética con un cubreobjetos. Fotografiar la diapositiva en un campo de luz visible.
NOTA: El área roja en la fotografía muestra una zona positiva rojo picrosirio bajo un microscopio a 200X aumentos. Calcular el porcentaje de la zona positiva rojo picrosirius sobre el área total, que indica la extensión de la fibrosis 11.
4. La troponina Cuantificación de sangre
- Cuantificar los niveles de troponina en plasmausando un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Ensayo de cada muestra por duplicado. Carga de 50 l de plasma de la sangre y 50 l de un cóctel de anticuerpos en los pocillos apropiados. Sellar la placa e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador de placas a 400 rpm.
NOTA: la troponina cardiaca en el plasma es un marcador de lesión cardiaca. - Aspirar el líquido y lavar cada pocillo con 250 l de tampón de lavado tres veces. Después del último lavado, invierta la placa y secar contra toallas de papel limpias para eliminar el exceso de líquido.
- Añadir 100 l de sustrato de tetrametilbencidina a cada pocillo y se incuba durante 10 min en la oscuridad en un agitador de placas a 400 rpm. Añadir 100 l de solución de parada a cada pocillo. Agitar la placa en un agitador de placas durante 1 min para mezclar. Registrar la densidad óptica (DO) a 450 nm.
NOTA: La concentración de troponina es proporcional al valor de la DO.
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Representative Results
10 semanas después de la cirugía constricción de la aorta abdominal, se analizó la patología cardíaca resultante. La histología cardiaca se mide calculando la proporción del peso del corazón con el peso corporal y mediante la detección de la cantidad de colágeno en el corazón. lesión cardíaca se confirmó mediante la medición de la concentración de troponina cardíaca plasma.
Como se muestra en la Figura 1A, el tamaño cardiaco se amplió después de la cirugía constricción de la aorta abdominal, como se demuestra por una mayor proporción de corazón peso-a-peso corporal (Figura 1B), un indicador de hipertrofia cardíaca. Mediante el uso de picrosirius tinción con rojo, el miocardio fibrótica manchado con un mayor contenido de colágeno (rojo) puede distinguirse de las zonas normales (amarillo, Figura 2). Fibrosis cardiaca se aumentó después de la cirugía constricción de la aorta abdominal (Figura 2B) en comparación con c ONTROLES (Figura 2A). Los resultados se correlacionan con las concentraciones plasmáticas de troponina (Figura 3). Un aumento de la concentración de troponina indica que se ha producido la remodelación cardiaca y lesiones durante la sobrecarga de presión. Tomados en conjunto, los resultados de constricción de la aorta abdominal en la lesión cardiaca evidente, marcados hipertrofia cardíaca, y la remodelación tisular.
Figura 1:. Hipertrofia cardiaca durante la sobrecarga de presión (A) del corazón Representante y (B) las relaciones de corazón-peso-a-peso corporal se muestran 10 semanas después de la cirugía constricción de la aorta abdominal. Los datos representan la media ± SEM de seis experimentos independientes realizados. Las diferencias entre grupos se evaluaron mediante la prueba t de Student. * P <0,05 frente al control. 8fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: fibrosis cardiaca durante la sobrecarga de presión.
Picrosirius tinción con rojo reveló aumento de la expresión de colágeno. (A) picrosirius Representante tinción con rojo (Escala bar = 200 m) y (B) el porcentaje de área fibrótica 10 semanas después de la cirugía constricción de la aorta abdominal. Los datos representan la media ± SEM de seis experimentos independientes realizados. Las diferencias entre grupos se evaluaron mediante la prueba t de Student. * p <0,05 frente al control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3: Lesión cardiaca durante la sobrecarga de presión.
Las concentraciones de troponina plasma sanguíneo se midieron 10 semanas después de la cirugía constricción de la aorta abdominal. Los datos representan la media ± SEM de seis experimentos independientes realizados. Las diferencias entre grupos se evaluaron mediante la prueba t de Student. * p <0,05 frente al control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G syringe needle | BD Biosciences | 309572 | |
| EDTA Blood Collection Tubes | BD Biosciences | REF365974 | |
| 4-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2515N | |
| 6-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2150N | |
| Pentobarbital | Sigma Aldrich | 1507002 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | |
| Picrosirius red solution | Abcam | ab150681 | |
| Cardiac troponin kit | Abcam | ab200016 | |
| Imagequant | Molecular Dynamics | ||
| Langendorff | ADInstruments | ML870B2 |
References
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