Visualizando o Tissue interrenais Steroidogenic e sua Vascular Microenvironment em Zebrafish
Summary
A glândula interrenal no peixe-zebra é a contrapartida teleósteos da glândula supra-renal de mamífero. Este protocolo apresenta a forma de realizar a desidrogenase de 3-hidroxiesteróides β (Δ 5-4 isomerase; 3β-HSD) ensaio da actividade enzimática, que detecta as células diferenciadas esteroidogênicas no peixe-zebra desenvolvimento.
Abstract
This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-β-Hydroxysteroid dehydrogenase /Δ5-4 isomerase (3β-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3β-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3β-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.
Introduction
A glândula adrenal, um componente crucial do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, segrega esteróides e coordena a homeostase esteróides e na resposta do organismo ao estresse. A glândula adrenal compreende o córtex exterior, que segrega esteróides de um modo específico da zona, e medula interna, que sintetiza catecolaminas. A glândula interrenal em teleósteos é o homólogo da glândula supra-renal em mamíferos e é composto de células cromafins e interrenais esteroidogênicas, que são equivalentes funcionais do córtex adrenal e medula, respectivamente 1-3. Estudos realizados utilizando o modelo de peixe-zebra têm relatado que ambas as linhagens celulares esteroidogênicas e cromafins são formados por mecanismos moleculares e celulares altamente semelhantes aos mamíferos em 1,2. Por isso, o peixe-zebra é um modelo potencialmente poderosa para o estudo de doenças genéticas, controlo neuroendócrino, e sistemas de biologia do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (interrenal).
<p class = "jove_content"> na glândula adrenal, 3β-HSD catalisa a conversão da progesterona a partir de pregnenolona, 17α-hidroxiprogesterona de 17α-hydroxypregnelolone, e androstenodiona a partir de desidroepiandrosterona 4,5. 3β-HSD é essencial para biosynthesizing todas as classes de esteróides hormonais, nomeadamente progesterona, glucocorticóides, mineralocorticóides, androgénios, estrogénios e. Os dois humana 3β-HSD isozimas HSD3B1 e HSD3B2 são diferencialmente expressos 6. HSD3B1 é expressa na placenta e nos tecidos periféricos, enquanto que HSD3B2 é expresso no córtex adrenal e das gónadas. HSD3B1 humano e HSD3B2 são co-ortólogos de hsd3b1 peixe-zebra, que é expressa no tecido interrenal e gónadas adultos; HSD3B2 peixe-zebra é um gene maternalmente expressa cuja transcrições desaparecer antes organogênese 7. O protocolo do ensaio de actividade de toda a montagem 3β-HSD enzimática para peixe-zebra foi desenvolvido através da modificação do método Levy,s descritas por Milano et al. , Em cortes congelados de oito espécies de teleósteos 8. Devido à permeabilidade dos tecidos e a transparência óptica do peixe-zebra desenvolvimento, todo-montagem 3β-HSD histoquímica pode ser usada com sucesso para o embrião do peixe-zebra fixa e larvas e especificamente delinear os tecidos interrenais diferenciadas.Este ensaio sensível e rápida foi aplicado a vários mutantes e morphants demonstrando diferentes tipos de dysmorphogenesis interrenal. A actividade 3β-HSD interrenal está ausente no embrião quando as especificações do tecido interrenal é interrompida através de um knockdown específica do factor de transcrição Ff1b e diminui à medida que a diferenciação interrenal é afectada por um knockdown da coregulator Ff1b Prox1 9,10. Notavelmente, a actividade 3β-HSD pode ser detectada em mutantes com defeitos graves da fase inicial, tais como uma cabeça de alfinete e de olhos estrabismo, onde o 3β-HSD histoquímica delineia como a migração celular é afectada interrenal 11. A diferenciação do tecido interrenal não é comprometida, mesmo na ausência total de sangue e vasculatura. Portanto, como os sinais derivados do endotélio moldar o órgão interrenal em desenvolvimento pode ser determinado 12,13. Em geral, este ensaio histoquímico foi usado com êxito para estudar especificação, diferenciação e migração de células esteroidogénicas no modelo de peixe-zebra. Portanto, ele deve ser um eficiente e uma ferramenta confiável para as telas genéticos ou químicos visando as disfunções dos órgãos supra-renais e interrenais.
Protocol
Representative Results
Discussion
A intensidade do sinal da actividade 3β-HSD aumentado ao longo do curso de reacção. Sinais claros de actividade 3β-HSD foram detectados após 4 horas de reacção para as fases de 28 HPF em diante. No entanto, a duração da reacção requer a determinação empírica, dependendo do objetivo do ensaio. Nos casos em que a coloração requer processamento durante a noite, um fundo ligeiramente azulado tende a desenvolver sobre as amostras. Este problema pode ser ultrapassado pelo aumento da duração de fixação …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Prof. Christoph Englert e Prof. Didier Stainier para presentear a Tg (wt1b: GFP) LI1 e Tg (kdrl: EGFP) s843 estirpes, respectivamente, e do Mecanismo de Taiwan Zebrafish núcleo para fornecer Tg (kdrl: mCherry) CI5. Este estudo foi apoiado por subsídios do Ministério da Ciência e Tecnologia (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3 de Taiwan, 102- 2321-B-400-018).
Materials
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Glycerol | USB | US16374 |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 |
| Tween 20 | Sigma | P9416 |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
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