JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

نموذج في المختبر لدراسة التحول الخلوي من هربس كابوزي ساركوما

Published: August 25, 2017
doi:
10.3791/54828
, , , ,
1Division of Pediatric Infectious Diseases,University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute,Oregon Health and Science University

Summary

ساركوما كابوزي (KS) ورم الناجمة عن العدوى بالفيروس النمطان الإنسان هربس-8/KS هربس (هف-8/كشف). نموذج الثقافة غشائي خلية الموصوفة هنا مناسبة فريدة لدراسة الآليات التي تحول كشف الخلايا المضيفة.

Abstract

ساركوما كابوزي (KS) هو ورم غير عادية تتألف من تكاثر المغزل الخلايا التي يتم تهيئتها بواسطة عدوى خلايا بطانية (EC) مع كشف، ويطور في أغلب الأحيان في الإعداد للكبت المناعي. على الرغم من عقود من البحث، لا يزال العلاج الأمثل من كانساس غير المحددة بوضوح والنتائج السريرية غير مواتية وبخاصة في الأماكن المحدودة الموارد. الآفات KS تحركها تولد الأوعية المرضية، والتهاب مزمن، وأونكوجينيسيس، وقد وضعت في المختبر خلية ثقافة نماذج مختلفة لدراسة هذه العمليات. KS ينشأ من الخلايا المصابة بكشف أصل غشائي، حيث توفر خلايا الجماعة الأوروبية-النسب في المختبر أنسب البدائل للسلائف الخلية المغزل. ومع ذلك، نظراً لأن الجماعة الأوروبية لها عمر محدود في المختبر ، واليات النمطان تستخدمهم كشف أقل كفاءة من تلك الفيروسات الورمية الأخرى، لقد كان من الصعب تقييم عمليات التحول في التعليم الابتدائي أو خلد تيلوميراسي ec. ولذلك، وضع نموذج رواية ثقافة تستند إلى المفوضية الأوروبية بسهولة يدعم التحول بعد الإصابة مع كشف. التعبير حمل خارج الرحم من جينات فيروس الورم الحليمي البشري النوع 16 E6 و E7 يسمح للثقافة الموسعة لمطابقة العمر ومرور وهمية وكشف-المصابين بالمفوضية الأوروبية ويدعم تطوير حقاً تحولت (أي، ورمي) النمط الظاهري في الثقافات الخلية المصابة . وسهلت هذا النموذج أصعب واستنساخه بدرجة عالية من كانساس اكتشاف عدة مسارات إشارات أساسية ذات الإمكانات العالية للترجمة إلى إعدادات السريرية.

Introduction

ساركوما كابوزي (KS) هو ورم أنجيوبروليفيراتيفي تنسيق المتعددة التي تؤثر على المواقع عن طريق الجلد والأغشية المخاطية الحشوي أن يطور الأكثر شيوعاً في الإعداد لقمع المناعة المتقدم1. وقد وصف النماذج الوبائية الأربعة: الكلاسيكية، وشكل من أشكال كسول عادة ما تؤثر على كبار السن من تراث البحر الأبيض المتوسط والشرق الأوسط؛ علاجية المنشأ، الناجمة عن المعالجة بالأدوية المثبطة للمناعة بعد زرع الأعضاء؛ هذا الوباء، تعريف الإيدز مرض سرطان؛ والمتوطنة، شكلاً مستقلاً عن فيروس نقص المناعة البشرية مشتركة في الأطفال في المناطق الموبوءة في أفريقيا. ومع ظهور أنظمة العقاقير المضادة للفيروسات الرجعية تركيبة فعالة لعلاج فيروس نقص المناعة البشرية، أقل بكثير عادة يتم تشخيص KS الوباء في البلدان النامية. ومع ذلك، تظل النماذج العدوانية سريرياً المتوطنة والوبائية بين الأكثر شيوعاً تشخيص السرطان في العديد من البلدان الأفريقية2،،من34. ولذلك، يعتبر تحديد أدوية فعالة تستهدف المرضية لعلاج كانساس أولوية بحثية.

الأشيع، تتميز الآفات KS neovascularization واسعة النطاق ولكن غير طبيعية حيث تشكل المغزل خلايا المنشأ الأوروبية شبكات الأوعية الدموية متقطع5. تسمح هذه السفن غير طبيعي (“الشقوق الأوعية الدموية”) التسرب من الكريات الحمراء، التي تعطي الآفات لون مميز. بالإضافة إلى ذلك، تتضمن الآفات الكريات البيضاء العديدة التي تميز الالتهاب المزمن (أي الخلايا الليمفاوية والضامة وخلايا البلازما). لقد وصف انحدار آفات كانساس بعد إعادة تشكيل المناعة، مما يوحي بأن سمات KS آفة فرط التكاثري وورم حقيقي6،،من78،9.

KS هربس (كشف)، المسبّب كانساس، حددت في عام 199410. منذ آنذاك كثيرة في المختبر خلية الثقافة-تم تطوير نماذج لتمكين الدراسات المرضية، بما في ذلك الخلايا اكسبلانتيد من المواد خزعة الورم والابتدائية أو المفوضية الأوروبية تعرب عن تيلوميراسي المصابين بكشف في المختبر11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18-أي من النماذج المتاحة حاليا ويجمل كانساس وورم المكروية تماما، ولكن جميعا أسهمت بمعرفة قيمة لفهم بل لكشف العدوى. خلافا الأخرى المعروفة ورمي الإنسان هربس فيروس ابشتاين-بار (EBV)، كشف عدم سهولة تحويل الخلايا في الثقافة عقب حيثياته العدوى19،،من2021، 22. ومع ذلك، تم التغلب على هذا القيد من ترانسدوسينج EC البشرية الأولية أما مختلطة الأصل ميكروفاسكولار أو اللمفاوية مع E6 واكتب E7 جينات من فيروس الورم الحليمي البشري 16 قبل الإصابة بكشف23،24 . التعبير عن هذه المسرطنة خارجية يزيد بشكل كبير احتمال تحويل لكشف في المختبر جزئيا بإتاحة المزيد من تثبيط الشبكية البروتين و p5323،24. أتاح هذا الأسلوب توصيل المفوضية الأوروبية مختبرات متعددة لتحديد التعديلات الرئيسية في المضيف التعبير الجيني في الخلايا التي هي الناجمة عن كشف العدوى والتي تظهر لتسهيل KS خلية البقاء على قيد الحياة وانتشار25،26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32-البروتوكولات المبينة في هذا التقرير مباشرة واستنساخه بدرجة عالية، وسوف تسفر عن توليد العمر ومرور مطابقة المفوضية الأوروبية كشف المصابين والمصابات موك عناصر التحكم التي يمكن أن يكون مثقف لأطول بكثير من الخلايا الأولية وسوف السماح بالتحقيق في آليات النمطان تستخدمهم كشف. على الرغم من أن البروتوكول يتضمن أسلوباً لإنتاج نوع المتوحش كشف من انصباب الابتدائي سرطان الغدد الليمفاوية الخلية خط BCBL-1، E6/E7-خلد الجماعة الأوروبية أيضا عرضه للعدوى مع باكميد المؤتلف المستمدة كشف BAC1630. يتم وصف بروتوكولات من أجل إعداد BAC16 في أماكن أخرى33،34.

Protocol

ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الإجراءات المبينة في هذا البروتوكول في ظروف BSL-2- 1-“إعداد الأوراق المالية كشف” TNE إعداد المخزن المؤقت: حل ملغ 292.24 يدتا في ddH 2 س وتقديمهم إلى 225 مل، وضبط لدرجة الحموضة 8. حل ملغ 605.7 تريس في ddH 2 س وتقديمهم إلى 225 مل، وضبط لدرجة الحموضة 8. الجم…

Representative Results

مورفولوجية EC الابتدائي الكلاسيكي توصف بأنها “حجر cobble”، ولا يتم تبديل هذا التشكل بالتعبير عن فيروس الورم الحليمي E6 و E7 الجينات (الشكل 1A). تعبير الجينات E6 و E7 وحدها لا الحث النمط الظاهري تحول؛ وهكذا، الخلايا عرضه للاتصال بتثبيط ويتوقف بتقسيم عند التوصل إلى التقاء ف?…

Discussion

أونكوجينيسيس هو عملية متعددة الخطوات التي تلتف ضمانات هامة داخل الكائن حي36. نظراً لعدم وجود آفات KS على طول طائفة التهاب مزمن الطويلا صحيح، يتطلب توضيح بعض العمليات الفيزيولوجية المرضية بكشف وساطة إجراء بعض الدراسات في نماذج الثقافة الخلية التي تدعم التحول9. تجد?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل قبل HD068322 K12 (SCM)؛ R01 CA179921 و P51 OD011092 للمركبات؛ وجائزة 14PRE20320014 من جمعية القلب الأمريكية (س. ب).

Materials

BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi’s sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi’s sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi’s sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi’s sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma. Science. 266 (5192), 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi’s sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi’s sarcoma?. Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi’s sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi’s sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi’s Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi’s sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3′-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder, ., Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

Tags

In Vitro ModelCellular TransformationKaposi Sarcoma HerpesvirusKSHVEndothelial CellsMalignant TransformationViral OncogenesisKaposi SarcomaPathological AngiogenesisBCBL-1 CellsPMAViral Particle IsolationUltracentrifugation
check_url/54828?article_type=t&slug=an-vitro-model-for-studying-cellular-transformation-kaposi-sarcoma

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image