विभिन्न methylated के मापन<em> आईएनएस</em> एक आइलेट के Biomarker β सेल मौत के रूप में मानव सीरम नमूनों में डीएनए प्रजाति
Summary
Islet β cell death precedes development of type 1 diabetes, and detecting this process may allow for early therapeutic intervention. Here, we provide a detailed description of how to measure differentially methylated INS DNA species in human serum as a biomarker of β cell death.
Abstract
The death of islet β cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank hyperglycemia, especially in type 1 diabetes. The development of sensitive and reliable biomarkers of β cell death may allow for early therapeutic intervention to prevent or delay the development of diabetes. Recently, several groups including our own have reported that cell-free, differentially methylated DNA encoding preproinsulin (INS) in the circulation is correlated to β cell death in pre-type 1 diabetes and new-onset type 1 diabetes. Here, we present a step-by-step protocol using digital PCR for the measurement of cell-free INS DNA that is differentially methylated at cytosine at position -69 bp (relative to the transcriptional start site). We demonstrate that the assay can distinguish between methylated and unmethylated cytosine at position -69 bp, is linear across several orders of magnitude, provides absolute quantitation of DNA copy numbers, and can be applied to samples of human serum from individuals with new-onset type 1 diabetes and disease-free controls. The protocol described here can be adapted to any DNA species for which detection of differentially methylated cytosines is desired, whether from circulation or from isolated cells and tissues, and can provide absolute quantitation of DNA fragments.
Introduction
टाइप 1 मधुमेह (T1D) एक autoimmune रोग है कि autoreactive टी कोशिकाओं 1 द्वारा कोशिकाओं β इंसुलिन के उत्पादन आइलेट के विनाश की विशेषता है। T1D के निदान के लिए आम तौर पर एक दुबला, युवा व्यक्ति, जो इंसुलिन की कमी के सबूत के रूप ketoacidosis के साथ उपस्थित हो सकता है में hyperglycemia (रक्त ग्लूकोज> 200 एमजी / डीएल) की माप पर किया जाता है। 2 – (90% 50 से) T1D के निदान के समय में, वहाँ β सेल समारोह और बड़े पैमाने पर की पर्याप्त नुकसान के लिए सबूत है। नैदानिक अध्ययन में, कई प्रतिरक्षा modulatory दवाओं है कि निदान के समय में स्थापित किया गया β सेल समारोह (और शायद मास), लेकिन कोई नहीं के स्थिरीकरण में हुई रोग के नैदानिक छूट में हुई है, एक खोज है कि विकास के लिए कॉल उठाया गया है रोग का पहले पता लगाने के लिए और के लिए बायोमार्कर के संयोजन की प्रभावशीलता के अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग 3,4 उपचार। अंतरराष्ट्रीय भागीदारी के प्रयासों, इस तरह के एकएस हीथ 5 के राष्ट्रीय संस्थानों में मानव आइलेट अनुसंधान नेटवर्क कंसोर्टियम, बायोमार्कर कि β सेल तनाव और T1D में मौत पर ध्यान केंद्रित विकसित करने की आवश्यकता पर बल दिया है।
9 – इन प्रयासों के साथ लाइन में, हमारे समूह और दूसरों को हाल ही में बायोमार्कर assays कि घूम उपाय, epigenetically संशोधित डीएनए टुकड़े कि β कोशिकाओं मर 6 से मुख्य रूप से उठता है विकसित किया है। तिथि करने के लिए प्रकाशित assays के सभी में, ध्यान केंद्रित मानव जीन एन्कोडिंग preproinsulin (आईएनएस) है, जो अन्य प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में कोडिंग और प्रमोटर क्षेत्रों में unmethylated सीपीजी साइटों का अधिक से अधिक डिग्री दर्शाता है के quantitation पर दिया गया है। Unmethylated आईएनएस डीएनए टुकड़े की मुक्ति (परिगलित, apoptotic) β कोशिकाओं मरने से मुख्य रूप से उत्पन्न होने के रूप में धारणा थी। हमारे हाल के अध्ययनों से पता चला है जवानी में, स्थिति -69 बीपी पर दोनों unmethylated और मिथाइल आईएनएस डीएनए में उन्नयन (टी के सापेक्ष किवह साइट शुरू Transcriptional) नई शुरुआत T1D में मनाया गया, और साथ में इस आबादी के लिए 6 के रूप में विशिष्ट बायोमार्कर की सेवा की। ये बायोमार्कर assays सीरम या प्लाज्मा वाणिज्यिक स्पिन किट का उपयोग करने से सेल मुक्त डीएनए के अलगाव, पृथक डीएनए के एक bisulfite रूपांतरण के द्वारा पीछा शामिल (uracils करने के लिए गैर methylated cytosines परिवर्तित करने के लिए methylated cytosines बरकरार छोड़कर)।
इस रिपोर्ट में, हम विभिन्न methylated आईएनएस डीएनए के लिए सीरम नमूना संग्रह, सीरम से सेल मुक्त डीएनए, bisulfite रूपांतरण, और छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर (इसके बाद, डिजिटल पीसीआर) के प्रदर्शन के अलगाव के तकनीकी पहलुओं का वर्णन है।
Protocol
Representative Results
Discussion
डीएनए Methyltransferases द्वारा cytosines के मेथिलिकरण कई जीनों पर प्रतिलेखन के epigenetic नियंत्रण के लिए अनुमति देता है। मानव में आईएनएस जीन लगभग विशेष कोशिकाओं β आइलेट में व्यक्त किया जाता है, और इसके प्रतिलेखन 11 का …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (to RGM). We wish to acknowledge the assistance of the Indiana Diabetes Research Center Translation Core supported by National Institutes of Health grant P30 DK097512.
Materials
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl and MgCl) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 mL PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
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