된 유의 메틸화 측정<em> INS</em> 바이오 마커 작은 섬의 β 세포 죽음 등 인간의 혈청 샘플에서 DNA 종
Summary
Islet β cell death precedes development of type 1 diabetes, and detecting this process may allow for early therapeutic intervention. Here, we provide a detailed description of how to measure differentially methylated INS DNA species in human serum as a biomarker of β cell death.
Abstract
The death of islet β cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank hyperglycemia, especially in type 1 diabetes. The development of sensitive and reliable biomarkers of β cell death may allow for early therapeutic intervention to prevent or delay the development of diabetes. Recently, several groups including our own have reported that cell-free, differentially methylated DNA encoding preproinsulin (INS) in the circulation is correlated to β cell death in pre-type 1 diabetes and new-onset type 1 diabetes. Here, we present a step-by-step protocol using digital PCR for the measurement of cell-free INS DNA that is differentially methylated at cytosine at position -69 bp (relative to the transcriptional start site). We demonstrate that the assay can distinguish between methylated and unmethylated cytosine at position -69 bp, is linear across several orders of magnitude, provides absolute quantitation of DNA copy numbers, and can be applied to samples of human serum from individuals with new-onset type 1 diabetes and disease-free controls. The protocol described here can be adapted to any DNA species for which detection of differentially methylated cytosines is desired, whether from circulation or from isolated cells and tissues, and can provide absolute quantitation of DNA fragments.
Introduction
제 1 형 당뇨병 (T1D)은 자기 반응성 T 세포를 1 β 세포의 인슐린 – 생성 췌장의 파괴를 특징으로하는자가 면역 질환이다. T1D의 진단은 일반적으로 인슐린 결핍의 증거로 케톤 산증으로 야기 될 수 있습니다 린, 젊은 개인에 고혈당 (혈당> 200 밀리그램 / DL)의 측정에 따라 이루어집니다. T1D의 진단시, β 세포 기능 및 질량의 상당한 감소에 대한 증거가있다 (50 – 90 %)이. 임상 연구에서, 진단시 제정 된 여러 면역 조절 성 약물, 질병의 임상 적 관해 이어질 β 세포 기능 (그리고 아마도 질량), 그러나 아무도의 안정화 개발을위한 전화를 제기 한 연구 결과를 초래 질병의 초기 탐지와 대한 바이오 마커의 조합의 효과의 길이 추적 3,4 치료. 국제 컨소시엄의 노력, 이러한히스 (5)의 국립 연구소에서 인간의 작은 섬 연구 네트워크 컨소시엄이야, T1D의 β 세포 스트레스와 죽음에 초점 바이오 마커의 개발 필요성을 강조했다.
9 – 이러한 노력에 맞춰, 우리 그룹 등 최근 β 세포 6 죽어 주로 발생, 후 성적 변형 된 DNA 조각을 순환 측정 바이오 마커 분석을 개발했다. 지금까지 발표 된 검정 모두에서, 초점이 다른 세포 유형에 비해 코딩 및 프로모터 영역의 비 메틸화 된 CpG 부위의 큰 정도를 보여주는 인간 유전자 부호화 preproinsulin (INS)의 정량에있다. 메틸화 INS DNA 단편의 해방은 (괴사, 세포 사멸) β 세포를 죽음에서 주로 발생으로 가정 하였다. 우리의 최근의 연구는 청소년, 위치 -69 bp의에서 메틸화 및 메틸화 모두 INS의 DNA에 고도는 (상대가 마에 것으로 나타났다그는 새로운 발병 T1D에서 관찰되었다) 사이트를 시작, 함께이 인구 6과 같은 특정 바이오 마커를 제공 전사. 이러한 바이오 마커 분석이 분리 된 DNA의 중아 변환 다음에 상용 스핀 키트를 사용하여 혈청 또는 혈장에서 무 세포 DNA의 분리를 포함 (우라실에 비 메틸화 된 시토신을 변환하는 그대로 메틸화 된 시토신을 떠나).
이 보고서에서 우리는 차별적 메틸화 INS DNA에 대한 혈청 샘플 수집, 혈청에서 무 세포 DNA, 중아 변환 및 (이제부터는, 디지털 PCR) 방울 디지털 PCR의 성능 분리의 기술적 측면에 대해 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA의 methyltransferases에 의해 시토신의 메틸화는 많은 유전자의 전사의 후생 유전 학적 제어 할 수 있습니다. 인간의 INS 유전자는 거의 독점적으로 세포 β 섬으로 표현, 그 전사 (11)의 침묵에 INS 유전자의 시토신 메틸화의 주파수 사이의 상관 관계가있을 나타납니다. 13 – 따라서, 대부분의 세포 유형은 세포를 11 β에 비해 다양한 사이토에서 INS 유전?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (to RGM). We wish to acknowledge the assistance of the Indiana Diabetes Research Center Translation Core supported by National Institutes of Health grant P30 DK097512.
Materials
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl and MgCl) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 mL PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, 32-39 (2005).
- Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
- Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
- . Human Islet Research Network | HIRN Available from: https://hirnetwork.org/ (2016)
- Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
- Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
- Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
- Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
- Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
- Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
- Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
- Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
- Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).
