Måling av Forskjellig metylert<em> INS</em> DNA Arter i humant serum som en biomarkør for Islet β celledød

Summary

Islet β cell death precedes development of type 1 diabetes, and detecting this process may allow for early therapeutic intervention. Here, we provide a detailed description of how to measure differentially methylated INS DNA species in human serum as a biomarker of β cell death.

Abstract

The death of islet β cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank hyperglycemia, especially in type 1 diabetes. The development of sensitive and reliable biomarkers of β cell death may allow for early therapeutic intervention to prevent or delay the development of diabetes. Recently, several groups including our own have reported that cell-free, differentially methylated DNA encoding preproinsulin (INS) in the circulation is correlated to β cell death in pre-type 1 diabetes and new-onset type 1 diabetes. Here, we present a step-by-step protocol using digital PCR for the measurement of cell-free INS DNA that is differentially methylated at cytosine at position -69 bp (relative to the transcriptional start site). We demonstrate that the assay can distinguish between methylated and unmethylated cytosine at position -69 bp, is linear across several orders of magnitude, provides absolute quantitation of DNA copy numbers, and can be applied to samples of human serum from individuals with new-onset type 1 diabetes and disease-free controls. The protocol described here can be adapted to any DNA species for which detection of differentially methylated cytosines is desired, whether from circulation or from isolated cells and tissues, and can provide absolute quantitation of DNA fragments.

Introduction

Type 1 diabetes (T1D) er en autoimmun sykdom som kjennetegnes av ødeleggelsen av insulin-produserende holmen β celler av autoreaktive T-celler ^1. Diagnosen T1D er vanligvis laget ved måling av hyperglykemi (blodsukker> 200 mg / dl) i en tynn, ung person, som kan presentere seg med ketoacidose som bevis på insulinmangel. På tidspunktet for diagnose av T1D, er det bevis for betydelig tap av β cellefunksjon og masse (50-90%) ^2. I kliniske studier, flere immunmodulerende legemidler som ble innstiftet ved diagnosetidspunktet resulterte i stabiliseringen av β-celle funksjon (og antagelig masse), men ingen har resultert i klinisk remisjon av sykdommen, et funn som har hevet call for utvikling av biomarkører for tidligere påvisning av sykdommen og for langsgående sporing av effektiviteten av kombinasjonsterapier ^3,4. Arbeidet med internasjonale konsortier, sliks Human Islet Research Network Consortium ved National Institutes of Heath ^5, har understreket behovet for å utvikle biomarkører som fokuserer på β-celle stress og død i T1D.

I tråd med dette arbeidet, har vår gruppe og andre nylig utviklet biomarkør analyser som måler sirkulerende, epigenetiske modifiserte DNA-fragmenter som oppstår i hovedsak fra å dø betacellene ^6-9. I alle de publiserte analyser til dags dato, har fokuset vært på kvantifisering av det menneskelige genet som koder preproinsulin (INS), som viser større grad av unmethylated CpG steder i kodingen og promoter regioner sammenlignet med andre celletyper. Frigjøringen av unmethylated INS DNA-fragmenter ble antatt som oppstår i hovedsak fra å dø (nekrotiske, apoptotiske) betaceller. Våre nyere studier viser at i ungdommen, økninger i både unmethylated og denaturert INS DNA ved posisjon -69 bp (i forhold til than Transkripsjonell starte stedet) ble observert i nyoppstått T1D, og sammen tjente som spesifikke biomarkører for denne populasjonen ^6. Disse biomarkør analyser involverer isolering av celle-fri DNA fra serum eller plasma ved hjelp av kommersielle kits ring, etterfulgt av en bisulfitt omdannelse av det isolerte DNA (for å omdanne ikke-denaturert cytosines til uraciler, forlater denaturert cytosines intakt).

I denne rapporten beskriver vi de tekniske aspektene av serumprøve samling, isolering av celle-fri DNA fra serum, bisulfitt konvertering, og resultatene av dråpe digital PCR (heretter, digital PCR) for forskjellig metylert INS DNA.

Protocol

Ethics Statement: Protocols were approved by the Indiana University Institutional Review Board. Parents of subjects provided written informed consent, and children older than 7 years provided assent for their participation. 1. Serum Processing NOTE: The assay as described has been rigorously tested using human serum isolated as follows. Collect blood in one red top (no-additive; uncoated) blood collection tube. Let sit at room temperature for 30 min to allow the clot to form. <li…

Representative Results

For å tolke data på riktig måte, bruker vi plasmid kontroller for både unmethylated og denaturert mål INS DNA i hver digital PCR-kjøring. Disse kontrollene sikre at signaler som tilsvarer metylert og unmethylated DNA skiller seg klart. Figur 1 viser 2-D-spredningsdiagrammer svarende til dråper for plasmid kontroller inneholdende bisulfitt-omdannet unmethylated INS-DNA (figur 1A), metanoldenaturert INS-DNA (figur …

Discussion

Metylering av cytosines av DNA metyltransferaser tillater epigenetisk kontroll av transkripsjon på mange gener. INS-genet hos mennesker er nesten utelukkende uttrykt i holmen β-celler, og det synes å være en sammenheng mellom frekvensen av metylering av cytosines i INS-genet til lyddemping av dens transkripsjon ^11. Som sådan er de fleste celletyper viser vesentlig høyere frekvenser av metylering av INS-genet ved forskjellige cytosines i forhold til p-celler ^{11 …}

Materials

Red Top Vacutainer	Beckon Dickinson	366441	no additive, uncoated interior, 10 ml
Cryovial Tube	Simport	T310-3A	polypropylene, screw cap tube, any size
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51106
Poly(A)	Sigma	P9403	disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl
Absolute Ethanol (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-500
DPBS (with CaCl and MgCl)	Sigma	D8662
0.2 mL PCR 8-strip Tubes	MidSci	AVST
8-strip Caps, Dome	MidSci	AVSTC-N
EZ DNA Methylation-Lightning Kit	Zymo	D5031
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)	Biorad	1863024
Buffer Control for Probes	Biorad	1863052
Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix	Life Technologies	AH21BH1
EcoR1	New England Biolabs	R0101L
twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted	Eppendorf	951020346
Pierceable Foil Heat Seal	Biorad	1814040
PX1 PCR Plate Sealer	Biorad	1814000
QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System	Biorad	1864101
Automated Droplet Generation Oil for Probes	Biorad	186-4110
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator	Biorad	186-4108
Pipet Tips for Automated Droplet Generator	Biorad	186-4120
Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator	Biorad	186-4125
C1000 Touch Thermal Cycler	Biorad	1851197
QX200 Droplet Reader	Biorad	186-4003
ddPCR Droplet Reader Oil	Biorad	186-3004