高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

Summary

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Abstract

細胞内の抗菌活性および真核細胞の細胞毒性の伝統的な対策は、エンドポイントアッセイに依存しています。このようなエンドポイントアッセイは、細胞溶解、コロニー形成単位の決意、または試薬の添加等の読み出しに先立って、いくつかの追加の実験工程を必要とします。アッセイの数千を行う場合、例えば、ハイスループットスクリーニング中に、アッセイのこれらのタイプのために必要な下流の労力が大きいです。したがって、ハイスループット抗菌発見を容易にするために、我々は、同時に細胞内の細菌増殖の阻害剤を同定し、真核細胞の細胞毒性を評価するためのリアルタイムアッセイを開発しました。具体的には、リアルタイム細胞内細菌増殖の検出は、細菌ルクスオペロン（ ^第 1 ^世代アッセイ）または蛍光タンパク質レポーター（ ^第 2 ^世代 、直交アッセイ）のいずれかで、細菌のスクリーニング株をマークすることで有効になっていました。非毒性、細胞膜非透過性、核酸結合色素また、マクロファージの初期感染時に追加されました。これらの色素は、生細胞から除外されます。しかし、非生存宿主細胞は、エントリと核DNA（デオキシリボ核酸）の蛍光標識を可能にする膜の完全性を失います。注目すべきことに、DNA結合は、宿主細胞死の溶液ベースの読み出しを提供する蛍光量子収率の大幅な増加と関連しています。我々は、マイクロプレート形式でハイスループットスクリーニングを実行するために、そして顕微鏡により細胞内増殖および細胞毒性を評価するために、この組み合わせアッセイを使用しています。注目すべきことに、抗菌剤は、一緒に適用二つ以上の抗菌剤の相乗効果は、別々に適用した場合よりも大きくなっている相乗効果を発揮することができます。異なる濃度の抗生物質の組み合わせの順列が評価されなければならないような細胞内病原体に対するin vitroでの相乗効果のためにテストすることは、通常、驚異的な作業です。しかし、私たちは、リアルタイムアッセイは自動化され、デジタルディスペンシング技術pで組み合わせることがわかりました容易な相乗効果のテストをermitted。これらのアプローチを使用して、我々は体系的に細胞内病原体、 レジオネラ・ニューモフィラに対してだけでは抗菌剤の多数のアクションと組み合わせてを調査することができました。

Introduction

細胞内区画に一時的に成長するか、存在する病原体が治療根絶することは困難です。義務または比較的ようなレジオネラ・ニューモフィラ 、Q熱リケッチア 、 ブルセラ属などの細胞内病原体を義務づけます。 、野兎病菌 、およびマイコバクテリウム属 。多くの場合、数ヶ月から数年もの範囲とすることができる治療法のための抗菌薬治療の長期のコースを必要とします。さらに、細胞外病原体は、一過性の細胞内ニッチを占め、このように抗菌薬治療の通常のコースによってクリアランスを逃れ、後に病原性感染症の新しいラウンドを開始するために出てくることがあります。 黄色ブドウ球菌 ¹及び尿路病原性腸内細菌^2,3感染は2ますます認識の例です。したがって、基本的な薬物発見の目的は、細胞内コンパートメントに浸透新規な抗菌剤を同定することです。迅速に根絶するための最適な治療法細胞内の生物サブ抑制抗菌剤暴露による耐性の発生を防止するには、特に望ましいです。

この目的のために、我々は、モデル病原体、 レジオネラ・ニューモフィラの細胞内増殖を標的細胞内浸透抗菌剤を同定するためのハイスループットスクリーニング技術を開発しました。 ⁴前臨床観察は、標準的な抗菌薬感受性試験は、正確にこの生物に対してインビボ治療効果が予測しなかったことを示しています。このようなβラクタムおよびアミノグリコシドなどの抗菌剤の主要なクラスは、無菌的に成長したレジオネラ菌に対して非常に有効であるが、十分にレジオネラ菌が存在する細胞内コンパートメント内に侵入しないため、 ^図5は、具体的には、これがありました。 ^5,6後で証拠は、技術的に、より複雑な細胞内増殖アッセイが効果的に臨床効果を予測することが示唆されました。 ⁷ </sup>残念ながら、これらのアッセイは、コロニー形成単位の計数のために、異なる時間点で、溶解する抗菌剤で処理された感染したマクロファージを、必要とする非常に面倒なエンドポイントアッセイは、ありました。このようなアッセイは、大規模に行うことは非現実的であり、高スループットの薬物発見のために不適当です。

したがって、我々は、細胞内細菌増殖のリアルタイム決意する技術を開発しました。 ⁶これは^、4または蛍光タンパク質⁹レポーター（ここで説明した第二世代、直交アッセイは、）は、細菌染色体に細菌ルシフェラーゼオペロン^8（前述した第1世代のアッセイ）のいずれかの統合により改変された細菌株の使用を通じて達成されました。このように、発光または蛍光シグナルは、細菌数のサロゲート、リアルタイムの読み出しを提供します。

しかし、これらの属性は、細胞内infectioの主要な交絡因子に対応していません宿主細胞上のnアッセイ、オフターゲット効果。具体的には、宿主細胞の死は、本質的に細胞内増殖を制限し、抗菌効果の偽陽性の同定をもたらします。スクリーニングライブラリのように多くの化合物は、毒性の真核細胞であり、このような偽陽性は、解決のためのフォローアップ、エンドポイントの細胞毒性アッセイを大量に必要と、真の抗菌剤を圧倒だろう。

これにより、同時に、真核生物細胞の生存および細胞内増殖を評価できることが非常に重要でした。注目すべきことに、非生存真核細胞の特性は、細胞膜の完全性の喪失です。細胞膜の透過性を試験するプローブは、したがって、細胞の生存率を評価するために使用されてもよいです。我々は、以前にアクセスし、死細胞の核DNAを染色する推定細胞膜非透過性、蛍光DNA結合色素の一連の能力を特徴とします。 ⁴核DNAを結合すると、これらの染料はquantuの大幅な増加を表示しますバックグラウンド溶液蛍光にわたって増加したシグナルが得られメートル蛍光収率。このように、これらの色素は、真核細胞死の定量的な読み出しを提供しました。 ^4は注目すべきことに、我々はいくつかは、J774マクロファージとの長時間の同時インキュベーションの間に自分自身に非毒性であることがわかりました。初期感染の間に添加された場合、それらは、マイクロプレート蛍光光度計により測定又は顕微鏡で観察することができる真核細胞死のリアルタイム蛍光読み出しが得られました。

従って、細菌のレポーターおよび非毒性、膜非透過性、DNA結合色素の使用を組み合わせることにより、我々は、同時に細菌負荷および真核細胞毒性の両方を測定するための簡単な、非破壊、リアルタイムアッセイを開発することができました。このアッセイは、私たちは〜250抗菌剤との細胞内増殖を阻害する能力のために機能的に特徴付けられていない活性を有する>24万小分子を含む384ウェルプレートフォーマット〜万知られている生物活性物質にスクリーニングすることができましたレジオネラ・ニューモフィラ 、同時に、各化合物の真核細胞の細胞毒性データを生成します。 ⁶ レジオネラ菌の細胞内増殖に対する既知の抗菌剤の我々の分析は、これまでのこのタイプの最も包括的な探査ました。 ⁶

組み合わせて使用​​する我々のアッセイフォーマットの効率に基づいて、我々はまた、続いて既知の抗菌剤の潜在的な相乗効果を調査しました。最も一般的な相乗作用試験の一つ、いわゆるチェッカーボードアッセイは、標準的に二つ以上の抗菌剤の二倍連続希釈の組み合わせ効果を評価することによって行われます。二つ以上の抗菌剤を別々に適用各々の効果の和よりも一緒に適用されたときに、これらのアッセイでは^{、図10に示すように} 、相乗効果は、より大きな効果を観察することにより定義されます。注目すべきは、これまで、唯一の集中と選択の相乗試験は、細胞内のレジオネラ・ニューモに対して行いました</em>が必要な組合せの順列を乗じた伝統的なエンドポイントアッセイに関与して多大な努力のため。

相乗効果のテストを容易にするために、我々は、自動化されたデジタルディスペンシング技術⁶との組み合わせで、当社のリアルタイム細胞内増殖/真核生物の細胞毒性アッセイを利用しました。この自動化は、384ウェル形式でDMSO単独の水溶液で、または組み合わせ中に溶解した化合物の連続希釈液を分配するために、私たちを可能にしました。 ^11はまた、このような強固な液体処理技術は、簡単に、より高い解像度を実行するために私達を許可し、平方根-の-2（むしろ標準よりも、低い解像度、倍増）我々の2つの次元で特異性の高いレベルを達成するために希釈組み合わせを、チェッカーボード相乗効果分析。この解像度が2倍希釈系列^12を使用した場合の再現性についてのシナジーフィールドの懸念に対処する上で特に有用でした。最後に、私たちのアッセイは、定量的ともTHERましたEFORE阻害の階調を測定しました。その結果、アッセイは、成長阻害の同様のレベルでのコンビナトリアル濃度を接続アイソコンターする等高線アイソボログラムで発現抑制情報の全体を、捕獲しました。 ⁶このプロット戦略は組み合わせ用量反応曲線の可視化を可能にしました。我々の方法論を例示するために、我々は、これらのアッセイを実施するための我々のプロトコルを記述し、代表的な結果を示します。

Protocol

1.リアルタイム細胞内増殖および真核細胞毒性アッセイ準備宿主細胞（J774A.1細胞） 9％の鉄補充ウシ血清を含むRPMI 1640中で懸濁液中文化J774A.1 ハツカネズミマクロファージ様細胞。最初は組織培養フラスコ内の通路。細胞は培地15 ml中に75cm 2の組織培養フラスコ中でコンフルエントになった後、15mlを組織培養フラスコに戻し、50mlを転写された媒体の同じタイプ、6…

Representative Results

マイクロプレートの細胞内増殖アッセイ 図1は、アッセイ工程をダイアグラム。示さ自動化の手順を手動で実行することができます。しかし、スループットが大幅に液体ハンドリングシステムを使用して促進されます。 図2は、384ウェルマイクロプレ?…

Discussion

我々は、細胞内の細菌の増殖および宿主細胞の細胞毒性の同時検出のためのリアルタイムアッセイを記載します。プロトコルにおけるいくつかの重要なステップがあります。まず、堅牢なアッセイ性能のために、細菌や細胞毒性の読み出しとの間に十分なスペクトル分離が存在しなければなりません。このような分離は、ルシフェラーゼオペロンの記者や蛍光DNA結合色素の組み合わせのため?…

Materials

J774A.1 cells	American Type Culture Collection	TIB-67	Host cell
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered	Becton-Dickinson/Difco	210929	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt	Sigma-Aldrich	K2000	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic	Thermo Fisher Scientific	P288-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C-7755	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate	Sigma-Aldrich	F5879	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water	N/A	N/A	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade)	Sigma-Aldrich	T1895	For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum	Gemini Bioproducts	100-510	For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
GelRed, 10000X solution in water	Biotium	41003	For staining for J774A.1 cell death determination by epifluorescence microscopy (in conjunction with green fluorescent bacteria). Use Gel Red  at 1X final concentration.
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker	BellCo Glass	7744-01010	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml – 1000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump	Thermo Fisher Scientific	5840300	For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold	Thermo Fisher Scientific	24072670	Default predispense volume of 20 ml is insufficient to compensate for settling — increase to 80 ml
White 384 well dishes treated for tissue culture	Corning	3570	For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules)	Sigma-Aldrich	D2650	For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot	Epson/ICCB-L	(Custom equipment)	For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	D300	For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 microliters
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	For dispensing test compounds
EnVision multi-mode plate reader	Perkin-Elmer	(Contact manufacturer)	For optimal detection of SYTOX Green fluorescence, use excitation filter 485/14, emission filter 535/25, and dichroic mirror 505 nm, with selection of minimum gain and transmittance, and “high concentration mode. For luminescence detection, use the "USLUM" protocol for high-sensitivity detection. For mNeptune2 detection, use excitation filter 600/8, emission filter 665/7.5, and dichroic mirror 658 nm, with selection of gain and transmittance to achieve the highest maximum signal possible without saturating the photomultiplier.
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera	Nikon	Ti	For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6	Adobe		Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10	Wolfam		For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.