High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit
Summary
A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.
Abstract
Traditionele maatregelen van intracellulair antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit afhankelijk eindpunt assays. Dergelijke eindpunt assays vereisen een aantal extra experimentele stappen voorafgaand aan het uitlezen, zoals cellysis, kiemgetal bepaling of reagens toevoeging. Bij het uitvoeren van duizenden testen, bijvoorbeeld tijdens high-throughput screening, de stroomafwaartse inspanning vereist voor deze soorten tests is aanzienlijk. Daarom bij hoge doorvoer antimicrobiële ontdekking vergemakkelijken, hebben we een real-time test gelijktijdig remmers van intracellulaire bacteriële groei bepalen en beoordelen eukaryote cel cytotoxiciteit. Specifiek werd realtime intracellulaire groei van bacteriën detectie mogelijk gemaakt door het markeren bacteriële screening stammen met ofwel een bacteriële lux operon (1e generatie-test) of fluorescerend eiwit reporters (2 e generatie, orthogonale test). Een niet-toxisch, celmembraan-impermeante, nucleïnezuurbindende dyewerd toegevoegd tijdens aanvankelijke infectie van macrofagen. Deze kleurstoffen zijn uitgesloten van levensvatbare cellen. Echter, niet-levensvatbare gastheercellen verliezen membraan integriteit waardoor binnenkomst en tl-etikettering van nucleair DNA (desoxyribonucleïnezuur). Met name DNA binding is geassocieerd met een grote toename van fluorescentie kwantumopbrengst dat een oplossing op basis uitlezen van ontvangst celdood verschaft. We hebben deze gecombineerde test gebruikt om een high-throughput screen in microplate format uitvoeren en intracellulaire groei en cytotoxiciteit beoordeeld met behulp van microscopie. Met name kan antimicrobiële synergie waarin het gecombineerde effect van twee of meer antimicrobiële stoffen wanneer zij samen toegepast groter dan wanneer afzonderlijk toegepast demonstreren. Testen op in vitro synergie tegen intracellulaire pathogenen gewoonlijk een wonderbaarlijke taak combinatoriële permutaties van antibiotica bij verschillende concentraties worden beoordeeld. Toch vonden we dat onze real-time analyse in combinatie met geautomatiseerde digitale afgifte technologie permitted facile synergie testen. Met behulp van deze benaderingen konden we systematisch overzicht werking van een groot aantal antimicrobiële alleen en in combinatie met het intracellulaire pathogeen, Legionella pneumophila.
Introduction
Ziekteverwekkers die in intracellulaire compartimenten groeien of verblijven tijdelijk moeilijk te therapeutisch roeien. Verplichten of relatief obligaat intracellulaire pathogenen zoals Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis en Mycobacterium spp. vereisen vaak langdurige cursussen van de antimicrobiële therapie voor de genezing die kunnen variëren van maanden tot zelfs jaren. Bovendien kan extracellulaire ziekteverwekkers tijdelijk bezet intracellulaire niches en zo ontsnappen goedkeuring door normale levels van antimicrobiële therapie en later ontstaan nieuwe serie virulente infectie te veroorzaken. Staphylococcus aureus 1 en uropathogene Enterobacteriaceae 2,3 infecties zijn twee steeds meer erkend voorbeelden. Daarom is een fundamentele ontdekking van geneesmiddelen doel is om nieuwe antibiotica die doordringen in intracellulaire compartimenten identificeren. Optimale therapie om snel uit te roeienintracellulaire organismen en de ontwikkeling van resistentie door middel van sub-remmende antimicrobiële blootstelling te voorkomen is in het bijzonder wenselijk.
Hiervoor hebben we een high-throughput screening technologie intracellulaire penetrant antimicrobiële targeting naar de intracellulaire groei van het model pathogeen, Legionella pneumophila identificeren. 4 Vorige klinische observaties wijzen erop dat standaard antimicrobiële gevoeligheid testen niet nauwkeurig te voorspellen in vivo therapeutische werkzaamheid tegen dit organisme. 5 In het bijzonder, was dit omdat grote klassen van antimicrobiële middelen, zoals β-lactamen en aminoglycosiden, hoewel zeer effectief tegen axenisch gegroeid Legionella, onvoldoende doordringen in de intracellulaire compartimenten waarin Legionella woont. 5,6 Later bewijs suggereerde dat technisch complexer intracellulaire groei assays effectief voorspeld klinische werkzaamheid. 7 </sup> Helaas zijn deze assays bewerkelijk eindpunten assays vereisen geïnfecteerde macrofagen behandeld met antimicrobiële stoffen, worden gelyseerd op verschillende tijdstippen punten kiemgetal opsomming. Dergelijke assays zijn onpraktisch te doen op grote schaal en niet geschikt voor high-throughput drug discovery.
Daarom ontwikkelden we technologie voor real-time bepaling van intracellulaire groei van bacteriën. 6 Dit werd bereikt door het gebruik van een bacteriële stam gemodificeerd door integratie van zowel een bacteriële luciferase operon 8 (eerste generatie assay hierboven beschreven) 4 of fluorescerend eiwit 9 reporters (tweede generatie orthogonale test hier beschreven) in het bacteriële chromosoom. Zo luminescerende of fluorescerend signaal verschaft een surrogaat, real-time uitlezen van aantal bacteriën.
Echter, deze attributen niet te pakken een belangrijke verstorende factor in de intracellulaire infection assays, off-target effecten op gastheercellen. In het bijzonder, de dood van de gastheercel beperkt inherent intracellulaire groei en leidt tot vals positieve identificatie van antimicrobieel effect. Zoals veel verbindingen in screening bibliotheken eukaryote cel giftig, zoals valse positieven zou gelden antimicrobiële overweldigen, noodzakelijk een groot aantal van de follow-up, endpoint cytotoxiciteit assays voor een oplossing.
Het was dus van groot belang om te kunnen eukaryote levensvatbaarheid van de cellen en intracellulaire groei tegelijkertijd beoordelen. Met name, een kenmerk van niet-levensvatbare eukaryote cellen is het verlies van celmembraanintegriteit. Probes die de permeabiliteit van de celmembraan testen kunnen daarom gebruikt worden om cellevensvatbaarheid te bepalen. We eerder gekarakteriseerde het vermogen van een reeks vermoedelijk celmembraan-impermeante, fluorescerende DNA-bindende kleurstoffen om vlekken en nucleaire DNA van dode cellen. 4 op binding nucleair DNA, deze kleurstoffen vertonen een grote toename van Quantum fluorescerende opbrengst resulteert in een verhoogde signaal over achtergrond oplossing fluorescentie. Als zodanig zijn deze kleurstoffen heeft het een kwantitatieve uitlezing van eukaryote celdood. 4 name, vonden we dat verschillende waren niet giftig zich tijdens langdurige co-incubatie met J774 macrofagen. Wanneer toegevoegd tijdens de eerste infectie, mits hij realtime de fluorescentie van eukaryote celdood kan worden gemeten met een microplaat fluorimeter of geobserveerd microscopisch.
Daarom combineert het gebruik van een bacteriële reporter en niet-toxisch, membraan-impermeante, DNA-bindende kleurstoffen, konden we een eenvoudige, niet-destructieve, real-time bepaling van zowel bacteriologische belasting en eukaryote cel cytotoxiciteit tegelijk meten. Deze test heeft ons toegelaten om het scherm in 384-well plaat formaat ~ 10.000 bekende bioactieve stoffen, waaronder ~ 250 antimicrobiële stoffen en> 240.000 kleine moleculen met functioneel uncharacterized activiteit voor de mogelijkheid om intracellulaire groei van de remmenLegionella pneumophila, terwijl tegelijkertijd het genereren eukaryote cel cytotoxiciteit voor elke verbinding. 6 Onze analyse van bekende antimicrobiële middelen tegen intracellulaire groei van Legionella was de meest uitgebreide verkenning van dit type tot nu toe. 6
Op basis van de efficiëntie van onze testformaat we vervolgens onderzocht de mogelijke synergistische effecten van bekende antimicrobiële stoffen bij gebruik in combinatie. Een van de meest voorkomende synergie proeven, de zogenaamde dambord assay wordt uitgevoerd door het bepalen standaard combinatorische effecten van tweevoudige seriële verdunningen van twee of meer antimicrobiële middelen. 10 In deze testen wordt synergie bepaald door de waarneming van groter effect wanneer twee of meer antimicrobiële middelen samen dan de som van de effecten van elk gemonteerde toegepast. Van de nota, tot nu toe, alleen gericht en selectieve synergie testen werden uitgevoerd tegen intracellulaire Legionella pneumophila </em> vanwege de grote inspanning bij het traditionele eindpunt assays vermenigvuldigd met de combinatorische permutaties vereist.
Synergie kunnen testen, maakten we gebruik van onze real-time intracellulaire groei / eukaryotische cytotoxiciteit assay in combinatie met geautomatiseerde digitale afgifte technologie 6. Deze automatisering mogen wij seriële verdunningen van verbindingen opgelost in DMSO of waterige oplossing alleen of in combinatie in 384 putjes afgeven. 11 Bovendien, zo krachtige vloeistofverwerking technologie mogen wij eenvoudig uitvoeren hogere resolutie, vierkantswortel van twee (in plaats van de standaard, resolutieverschillen verdubbeling) verdunning combinaties met hogere specificiteit in onze tweedimensionale bereiken, schaakbord synergie analyse. Deze resolutie is bijzonder waardevol bij het aanpakken van problemen op het gebied van synergie over de reproduceerbaarheid bij het gebruik van tweevoudige verdunningsreeks 12. Tenslotte onze test was kwantitatief en ook therefore gemeten gradaties van remming. Als resultaat was de zuiverheid gevangen het geheel van remmende informatie expressie in isocontour isobolograms waarin isolijnen verbinding combinatorische concentraties met een vergelijkbaar niveau van groeiremming. 6 Deze plotten strategie liet visualisatie van combinatorische dosis-respons curves. Om onze methodologie te illustreren, beschrijven we ons protocol voor het uitvoeren van deze testen en tonen representatieve resultaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven real-time assays voor gelijktijdige detectie van intracellulaire groei van bacteriën en gastheercellen cytotoxiciteit. Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol. Ten eerste, voor robuuste test prestaties, moet er voldoende spectrale scheiding tussen bacteriële en cytotoxiciteit uitlezingen zijn. Een dergelijke scheiding is intrinsiek voor combinaties van luciferase operon reporters en TL-DNA-bindende kleurstoffen. Op basis van onze ervaring (Tabel 1-3, figuur 2),</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek gemeld in dit manuscript werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten van de National Institutes of Health onder award nummer R01AI099122 om Jek De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Gezondheid. We willen graag bedanken Jennifer Smith, David Wrobel, Su Chiang, Doug Flood, Sean Johnston, Jennifer Nale, Stewart Rudnicki, Paul Yan, Richard Siu en Rachel Warden uit de ICCB-Longwood Screening Facility en / of het National Screening Laboratorium voor de New England Regionale Centers of Excellence in Biodefense en Emerging Infectious Diseases (gesteund door U54AI057159) voor hun hulp bij de ontwikkeling en de prestaties van high-throughput screening assays. We willen ook graag bedanken Kenneth P. Smith voor nuttige opmerkingen over het manuscript.
Materials
| J774A.1 cells | American Type Culture Collection | TIB-67 | Host cell |
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Yeast extract, ultrafiltered | Becton-Dickinson/Difco | 210929 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors |
| Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt | Sigma-Aldrich | K2000 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Potassium phosphate, dibasic | Thermo Fisher Scientific | P288-500 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C-7755 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Ammonium iron(III) citrate | Sigma-Aldrich | F5879 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately |
| Potassium hydroxide solution, concentrated | Thermo Fisher Scientific | SP236-500 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Deonized water | N/A | N/A | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Thymidine (tissue culture grade) | Sigma-Aldrich | T1895 | For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640 |
| RPMI 1640, standard formulation | Corning via Thermo Fisher Scientific | 10-040-CV | For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine |
| RPMI 1640 lacking phenol red | Corning via Thermo Fisher Scientific | 17-105-CV | For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use |
| L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade) | HyClone via Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration |
| Iron-supplemented calf serum | Gemini Bioproducts | 100-510 | For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density |
| SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S7020 | For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration. |
| GelRed, 10000X solution in water | Biotium | 41003 | For staining for J774A.1 cell death determination by epifluorescence microscopy (in conjunction with green fluorescent bacteria). Use Gel Red at 1X final concentration. |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-255-26 | For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead) |
| Orbital shaker | BellCo Glass | 7744-01010 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately) |
| Shaker flasks (250 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-2038-04 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Shaker clamps for flasks (250 ml) | BellCo Glass | 7744-16250 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Shaker flasks (1000 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-2038-07 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Shaker clamps for flasks (1000 ml) | BellCo Glass | 7744-16100 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Sponge foam caps for flasks (250 ml – 1000 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-1490-038 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps |
| MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes |
| Combi standard bore manifold | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | Default predispense volume of 20 ml is insufficient to compensate for settling — increase to 80 ml |
| White 384 well dishes treated for tissue culture | Corning | 3570 | For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully |
| DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules) | Sigma-Aldrich | D2650 | For dissolving positive control and test compounds |
| Azithromycin | Sigma-Aldrich | PHR1088 | Antibiotic positive control |
| Saponin (from Quillaja bark) | Sigma-Aldrich | S-4521 | Cytoxicity positive control |
| Multichannel pipettor | Thermo Fisher Scientific | Finnpipette | For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing |
| Epson pin transfer robot | Epson/ICCB-L | (Custom equipment) | For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays |
| D300 digital dispensing system | Hewlett-Packard via Tecan | D300 | For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 microliters |
| T8+ cartridges for D300 digital dispensing system | Hewlett-Packard via Tecan | T8+ | For dispensing test compounds |
| EnVision multi-mode plate reader | Perkin-Elmer | (Contact manufacturer) | For optimal detection of SYTOX Green fluorescence, use excitation filter 485/14, emission filter 535/25, and dichroic mirror 505 nm, with selection of minimum gain and transmittance, and “high concentration mode. For luminescence detection, use the "USLUM" protocol for high-sensitivity detection. For mNeptune2 detection, use excitation filter 600/8, emission filter 665/7.5, and dichroic mirror 658 nm, with selection of gain and transmittance to achieve the highest maximum signal possible without saturating the photomultiplier. |
| Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera | Nikon | Ti | For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution |
| Glass-bottom tissue culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope. These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms. |
| Photoshop CS6 | Adobe | Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images. | |
| Mathematica 10 | Wolfam | For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms. |
References
- Garzoni, C., Kelley, W. L. Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence. Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).
- Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infect Immun. 76 (7), 3337-3345 (2008).
- Blango, M. G., Mulvey, M. A. Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics. Antimicrob Agents Chemother. 54 (5), 1855-1863 (2010).
- Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 219-228 (2014).
- Edelstein, P. H. Antimicrobial chemotherapy for legionnaires’ disease: a review. Clin Infect Dis. 21 Suppl 3, S265-S276 (1995).
- Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. High-Throughput Intracellular Antimicrobial Susceptibility Testing of Legionella pneumophila. Antimicrob Agents Chemother. 59 (12), 7517-7529 (2015).
- Pedro-Botet, L., Yu, V. L. Legionella: macrolides or quinolones?. Clin Microbiol Infect. 12 Suppl 3, 25-30 (2006).
- Coers, J., Vance, R. E., Fontana, M. F., Dietrich, W. F. Restriction of Legionella pneumophila growth in macrophages requires the concerted action of cytokine and Naip5/Ipaf signalling pathways. Cell Microbiol. 9 (10), 2344-2357 (2007).
- Chu, J., et al. Non-invasive intravital imaging of cellular differentiation with a bright red-excitable fluorescent protein. Nat Methods. 11 (5), 572-578 (2014).
- Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C., Lorian, V. Ch. 9. Antimicrobial combinations. In: Antibiotics in Laboratory Medicin. , 330-396 (1996).
- Jones, R. E., Zheng, W., McKew, J. C., Chen, C. Z. An alternative direct compound dispensing method using the HP D300 digital dispenser. J Lab Autom. 18 (5), 367-374 (2013).
- Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. J Antimicrob Chemother. 52 (1), (2003).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Berger, K. H., Merriam, J. J., Isberg, R. R. Altered intracellular targeting properties associated with mutations in the Legionella pneumophila dotA gene. Mol Microbiol. 14 (4), 809-822 (1994).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 7 (1), 7-19 (1993).
- Vogel, J. P., Isberg, R. R. Cell biology of Legionella pneumophila. Curr Opin Microbiol. 2 (1), 30-34 (1999).
- Kirby, J. E., Isberg, R. R. Legionnaires’ disease: the pore macrophage and the legion of terror within. Trends Microbiol. 6 (7), 256-258 (1998).
- Kirby, J. E., Vogel, J. P., Andrews, H. L., Isberg, R. R. Evidence for pore-forming ability by Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 27 (2), 323-336 (1998).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279 (5352), 873-876 (1998).
- Song, H., Fares, M., Maguire, K. R., Sidén, A., Potácová, Z. Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells. PLoS ONE. 9 (12), e114457 (2014).
- Isberg, R. R., Falkow, S. A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12. Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opin Drug Discov. 3 (6), 655-669 (2008).
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).
- Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 9 (5), 580-588 (2009).
- Dunlap, P., Thouand, G., Marks, R. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology – Volume 1. 1, 37-64 (2014).
