Endotheelcellen mitochondriën zijn van cruciaal belang voor de bloed-hersen-barrière integriteit te behouden. We introduceren een protocol om bio-energetische functie meten cerebrale vasculaire endotheliale cellen.
De integriteit van de bloed-hersen-barrière (BBB) is kritisch voor hersenletsel voorkomen. Cerebrale vasculaire endotheel (CVE) cellen zijn een van de celtypes die de BBB omvatten; Deze cellen hebben een vraag naar zeer hoge-energie, die een optimale mitochondriale functie vereist. Bij ziekte of verwonding kan de mitochondriale functie in deze cellen worden gewijzigd, waardoor de ziekte of de opening van de BBB. In dit manuscript, introduceren we een methode om mitochondriale functie in CVE-cellen te meten met behulp van hele, intacte cellen en een bioanalyzer. Een mito stress test wordt gebruikt om de cellen die zijn verstoord, fysiek of chemisch uitdaging en de bio-energetische functie geëvalueerd. Daarnaast biedt deze methode biedt ook een handige manier om nieuwe therapieën die directe effecten op de mitochondriale functie te screenen. We hebben geoptimaliseerd de celdichtheid noodzakelijk zuurstofverbruik wel voldoende voor de berekening van verschillende mitochondriale para opleverenmeter, met inbegrip van ATP productie, maximale ademhaling, en reservecapaciteit. We de gevoeligheid van de test tonen ook door aan te tonen dat de introductie van de microRNA, miR-34a, leidt tot een uitgesproken en waarneembare afname van mitochondriale activiteit. Hoewel de in dit artikel gegevens geoptimaliseerd voor het bEnd.3 cellijn, hebben we ook geoptimaliseerd protocol voor primaire CVE cellen, wat suggereert verder het nut in preklinische en klinische modellen.
Algemeen wordt erkend dat de bloed-hersen-barrière (BBB) gevormd door cerebrale vasculaire endotheliale (CVE) cellen heeft zeer aparte en unieke functies essentieel vasculaire biologie. Deze endotheelcellen gebruiken mitochondriën de meeste cellulaire levering van adenosine trifosfaat (ATP) genereren als een bron van chemische energie. Naast het leveren van ATP voor de CVE cellen, mitochondria diverse cellulaire processen reguleren in vasculaire endotheelcellen, zoals cellulaire signalering 1-4, apoptose 5, en controle van de celcyclus en celgroei 6. Ontregeling van bio-energetische mitochondriale functie in cellen CVE kunnen mitochondriale biogenese beïnvloeden, wat leidt tot verslechterde vasculaire endotheel activiteit en verergeren cerebrovasculaire ziekten en neurodegeneratieve aandoeningen, bijvoorbeeld beroerte 7,8 en de ziekte van Alzheimer (AD) 9. We hebben aangetoond dat beledigingen CVE cellen na blootstelling aan lipopolysacsacharide (LPS) schaden mitochondriale functie in CVE-cellen en verergeren beroerte uitkomsten 7. Tert-butylhydrochinon (tBHQ) stijgt de sterfte door te interfereren met oxidatieve fosforylering in CVE cellen 10. Daarom is de kwantitatieve model van bio-energetische functie CVE cellen niet alleen piloten een serie-mechanisme gerelateerde studies centrale zenuwstelsel (CNS) aandoeningen, maar ook een doorbraak in drug screening van therapeutische targeting mitochondriale vasculaire biologie.
Geïsoleerde mitochondriën werden gebruikt om bioenergetica functie te meten. We 7 en anderen hebben 11 evaluaties van cellulaire bio-energetica in intacte cellen CVE gemeld door het gebruik van een extracellulaire flux bioanalyzer. De analysator verschaft het voordeel van endogene cellulaire bio-energetische evaluatie. Deze gevoelige en consequente test meet de mitochondriale metabolisme van CVE cellen en kan worden gebruikt om bioenergetic aantasting door sti evaluerenmuli, onderzoek naar de mechanismen van mitochondriale signaalwegen, en het scherm medicijnen of behandelingen die mitochondriale functie in CVE-cellen te beïnvloeden. Het zuurstofverbruik Rate (OCR) wordt opgenomen door het bioanalyzer met een farmacologische profilering benadering combineert het gebruik van vier mitochondriale verstoorders: oligomycin, carbonyl cyanide-4 (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP), rotenon en antimycin A. In dit protocol we detail een geoptimaliseerde benadering waarmee het meten en berekenen van mitochondriale functionele parameters CVE cellen, waaronder basale mitochondriale ademhaling, ATP productie, proton lek, maximale ademhaling en reservecapaciteit ademhalingscapaciteit, in een enkele assay.
Dit protocol is een werkwijze voor het evalueren van de bio-energetische fenotype in cerebrale vasculaire endotheelcellen. Het dient als basis voor de bepaling endotheelcel mitochondriale evaluatie en is optimaal voor experimenten ontworpen om de mechanismen van stimuli die de mitochondriale signaling pathway in CVE cellen kunnen beïnvloeden onderzoeken. Het biedt ook een werkwijze voor het testen van potentiële geneesmiddelen voor BBB-verstoring geassocieerde ziekten.
Kritische stappen in het protocol
Extracellulaire flux bioanalyzers hebben de mogelijkheid om OCR te meten in real time. In deze test, identificatie van de geschikte celdichtheid is kritisch. Als de celdichtheid is dan 8 x 10 3 cellen per putje, de basale OCR te laag te analyseren (Figuur 2 en Figuur 3); als de cel dichtheid hoger is dan 32 × 10 3 cellen per putje, doen de cellen niet reageren op oligomycin of FCCP treatmegen (Figuur 2 en Figuur 3). De optimale celdichtheid voor deze cellijn in onze experimentele model is 16 × 10 3 cellen per well, die reproduceerbare resultaten en de gevoeligheid toont op prikkels 7 en behandelingen 10,14. Als een 24-wells bioanalyzer wordt gebruikt, zou nieuwe titraties van de celdichtheid vereist voor de test.
Het is gedocumenteerd dat CVE's een grote hoeveelheid mitochondria vergelijking met andere endotheliale cellen of weefseltypes 15,16, suggereert de noodzaak van een grotere energieproductie en minder cellen voor het meten bioenergetica metabolisme. We hebben verschillende soorten brein endotheelcellen, zoals primaire en geïmmortaliseerde muizen getest cerebrovasculaire endotheelcellen 7 en geïmmortaliseerde humane cerebrovasculaire endotheel cellen (ongepubliceerde gegevens). Deze cellen nodig vergelijkbaar celdichtheden de aanvaardbare OCR (basale ademhaling OCR bereiken binnen 40-160 pmol / min voor96-well platen en 50-400 pmol / min gedurende 24 putjes) als de bio-energetica werd uitgevoerd. Kaczara et al. Beschreven meten bio-energetische metabolisme in humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC), die een hogere celdichtheid 17 gebruikt.
Onze fractie heeft geen vat cellen uit andere weefsels of organen te evalueren. Theoretisch zou het mogelijk bioanalyzer gebruikt worden op elk celtype, maar vereist het optimaliseren van de test voor de celdichtheid, celkweekmedium en kweekomstandigheden (een speciale cellen kunnen vereisen beklede platen om goed te groeien). Het is nodig dat de experimenten worden voltooid om te zorgen voor de OCR dosis binnen het aanvaardbare bereik. Als de OCR in endotheliale cellen van andere organen is lager dan CVE's van de hersenen, het verhogen van de celdichtheid kan helpen binnen een acceptabel OCR bereik te krijgen. Als alternatief, als de cellen geen gebruik maakt van oxidatieve fosforylering als hun belangrijkste bron van energie, de bioanalyzer zou geen optima zijnl assay.
De bioanalyzer maakt de sequentiële verstoring van de elektronentransport keten, gebaseerd op de volgorde waarin de reagentia worden toegepast. Eerst wordt oligomycin toegepast, die mitochondriale complex V (ATP synthase) remt. Tweede FCCP, een elektron ontkoppelrail, wordt toegepast, hetgeen leidt tot verstoring van de protongradiënt. Tenslotte rotenon en antimycin A, die remt mitochondriale complexen I en III respectievelijk worden toegevoerd aan tot een totale remming van de elektronenstroom. De volgorde van blootstelling aan het geneesmiddel is essentieel omdat de medicijnen blokkeren de specifieke elektronenvervoer kettingreactie en de opeenvolgende veranderingen kunnen worden gemeten om de mitochondriale functie weerspiegelt.
Wijzigingen en problemen oplossen
Om mitochondriale reactie op prikkels in CVE-cellen te evalueren, is het raadzaam dat de stimuli worden toegepast op cellen na de cellen worden gehecht aan de celkweek plaat bodem (zie de tijdlijnfiguur 1; duurt meestal minstens 6 uur). Om reproduceerbare resultaten te verkrijgen door behandelingen, is het uiterst belangrijk om de celdichtheid consistent. Als voorbehandeling voorafgaand aan zaaien van cellen is gemaakt, moet celdichtheid per voorbehandeling nauwkeurig worden gemeten, met uitzondering van de dode cellen te zaaien. Als transfectie is opgenomen in de experimentele opzet, wordt verwezen naar de fabrikant transfectie protocol. Blijkt uit de gegevens weergegeven in Figuur 4, werd miR-34a getransfecteerd in de CVE cellen met een lipofectamine transfectie kit, die antibiotica-vrij celkweekmedium en een mito-stresstest vereist dat de veranderingen in metabole functie overexpressie van miR-34a beoordelen . De doses van plasmide kunnen zijn geoptimaliseerd, zoals eerder gepubliceerd 13. Een andere verandering die kan worden aangebracht in het protocol verandert de concentratie van de reagentia. Een titratie curve van oligomycin, FCCP, en / of rotenon en Antimycin A kan worden completed.
Daarnaast, indien deze test wordt gebruikt voor high throughput analyse van diverse drugs, wordt voorgesteld om een parallelle bepaling voor cellevensvatbaarheid en celproliferatie, die in onze eerdere publicaties beschreven werd 7,13 meten omvatten. De OCR waarden worden sterk beïnvloed door het aantal cellen (figuren 2 en 3) en de celproliferatie en levensvatbaarheid-assays ten goede aan de normalisering van de gegevens. De voltooiing van deze testen zijn bij de beoordeling van elke betreffende laboratorium.
Beperkingen van de Techniek
De belangrijkste beperking van dit protocol is dat we alleen een in vitro celkweek model in de studie. Momenteel zijn er geen beschikbare ex vivo modellen of diermodellen die endotheelcel mitochondriale functie kan richten. Nieuwe modellen zouden moeten worden ontwikkeld voor de beoordeling van bio-energetische functie in vivo en <em> ex vivo in de toekomst studies.
Een andere beperking is de uitbreiding van de barrière evaluaties na bioenergetica maatregelen. De experimenten kan niet worden uitgevoerd omdat, ten eerste, na de voltooiing van de bio-energetische metingen, de cellevensvatbaarheid wordt verminderd na de volledige verstoring van de elektronen transportketen; tweede worden specifieke celkweek platen en inserts die nodig zijn om bio-energetica waarden op te sporen en niet inzetstukken voor slagboom assessments passen. Daarom zijn er niet veel functionele bepalingen die na de bio-energetica test kan worden voltooid. Er wordt echter verwacht dat bijzondere inrichtingen kunnen worden ontwikkeld om functionele testen voor de bio-energetica analyse uit te voeren.
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / Alternative Methods
Previous technieken mitochondriale functie uitwerkt noodzakelijk de isolatie van de mitochondria van de cellen 18. dit new techniek met de bioanalyzer maakt meting van mitochondriale activiteit in intacte cellen die meer van het cellulaire milieu dan evalueren geïsoleerde mitochondria behoudt.
Toekomstige toepassingen of richtingen na Mastering deze techniek
Dit protocol is ontworpen en ontwikkeld voor de bEnd.3 cellijn, maar het is ook compatibel met de primaire cerebrale vasculaire endotheliale (pCVE) cellen 7 of andere endotheel, en we hebben dit aangetoond in onze eerdere publicatie met behulp van pCVE cellen 7. Bij andere typen endotheel worden gebruikt, kan de bekleding van de kweekplaat en het gebruik van groeifactoren vereist. Echter, de titratie assay aanbevolen voor andere celtypes ook. Dit protocol heeft een algemene werkwijze die bij de evaluatie van de bio-energetica van CVE cellen worden vastgesteld, en kan verder worden toegepast op studies mechanisme of therapeutische respons op deze manier.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the following grants: AHA 16SDG31170008 to X.R. and NIH P20 GM109098, P01 AG027956, and U54 GM104942 to J.W.S.
bEnd.3 cell line | ATCC | CRL-2299 | 25-30 passages |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S12450 | 10% in final |
Penicillin/Steptomycin | Hyclone | SV30010 | 1×100 stocking |
0.25% trypsin 0.03% EDTA solution | Corning | 25-053-CI | |
Sodium pyruvate | Corning | 25-000-CI | 1.0 µM in final |
Glucose | Sigma | CAS 50-99-7 | 25 mM in final |
Oligomycin | Sigma | O4876 | 1.0 µM in final |
Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | 0.5 µM in final |
Rotenone | Sigma | R8875 | 1.0 µM in final |
Antimycin A | Sigma | CAS 1397-94-0 | 1.0 µM in final |
Plate wash station | Seahorse Bioscience | ||
Extracellular flux bioanayzer | Seahorse Bioscience | XFe96 | |
Extracellular flux cell culture plate | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
Extracellular flux sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
Extracellular flux calibrant solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
Extracellular flux assay medium | Seahorse Bioscience | 102365-100 | PH buffered prior to assay |